姜黃素減緩模擬微重力誘導(dǎo)的骨質(zhì)丟失機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　微重力條件下，人體受力學(xué)環(huán)境的改變會(huì)引起人體多個(gè)系統(tǒng)、器官和組織發(fā)生顯著而持續(xù)的生理病理變化，而微重力誘發(fā)的骨質(zhì)丟失是其中非常突出的問(wèn)題之一。微重力引發(fā)的骨質(zhì)疏松增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)，限制了人類對(duì)太空的探索;而且微重力與長(zhǎng)期臥床制動(dòng)誘發(fā)的骨質(zhì)疏松，同屬?gòu)U用性骨質(zhì)疏松，病理機(jī)制非常相似。因此，研究微重力環(huán)境下誘發(fā)骨質(zhì)丟失的機(jī)制并找到相應(yīng)的對(duì)抗策略，對(duì)于宇航人員和長(zhǎng)期臥床的人群都具有非常重要的意義。
　　目前，微重力誘發(fā)

2、骨質(zhì)丟失的確切機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)有的對(duì)抗方案也不理想。近些年，氧化應(yīng)激(Oxidative stress)在骨質(zhì)疏松病理機(jī)制中的作用引起廣泛關(guān)注。在雌激素水平下降和年齡增長(zhǎng)引發(fā)的骨質(zhì)疏松中，都發(fā)現(xiàn)活性氧自由基(ROS，Reactive oxygen species)在體內(nèi)大量蓄積，而且應(yīng)用抗氧化應(yīng)激藥物在防治上述兩種骨質(zhì)疏松方面也取得了不錯(cuò)的效果。近來(lái)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可能在微重力誘發(fā)的骨質(zhì)丟失方面也起到了非常重要的作用，并且通過(guò)體外實(shí)

3、驗(yàn)也取得了積極效果。因此，有必要尋找或開(kāi)發(fā)具備抗氧化應(yīng)激的理想藥物，來(lái)防治微重力誘發(fā)的骨質(zhì)丟失。
　　姜黃素(C21H20O6)是從姜黃的根莖中提取的一種天然酚醛樹(shù)脂，是一種天然抗氧化劑以及自由基清除劑。作為烹飪調(diào)味品，它已經(jīng)被東方民族廣泛應(yīng)用，還用于治療疾病，包括糖尿病、肝膽病變、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和胃腸病變等。近來(lái)，姜黃素作為潛在的治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松藥物引起了科學(xué)家的關(guān)注。它可以改善絕經(jīng)后引起的骨質(zhì)疏松，以及牙周炎引起的骨質(zhì)丟失。另

4、外，姜黃素可改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的骨纖維結(jié)構(gòu)和提高骨礦質(zhì)密度。有的報(bào)道認(rèn)為姜黃素是雙向抗氧化劑，它能夠直接與活性氧反應(yīng)，誘導(dǎo)具有細(xì)胞保護(hù)作用和抗氧化作用的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。另外，姜黃素也能夠與維生素D受體結(jié)合(VDR)，激活維生素D受體目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。而姜黃素能否緩解微重力條件下引發(fā)的骨質(zhì)丟失，還有待探討。
　　目的：
　　1.研究姜黃素對(duì)于模擬微重條力件下成骨細(xì)胞代謝和分化等功能的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　

5、2.研究姜黃素對(duì)于模擬微重條力件下破骨細(xì)胞生成和代謝的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　3.研究模擬微重力條件對(duì)于SD大鼠骨代謝的影響，探討姜黃素對(duì)于模擬微重力條件下SD大鼠骨質(zhì)丟失的影響及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS，Rotary cell culture system)模擬體外微重力條件，體外培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞。根據(jù)不同處理方法將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為四組:(1)1G重力對(duì)照組(Con);

6、(2)1G重力+姜黃素對(duì)照組(Con+CUR，4μM);(3)模擬失重組(MG);(4)模擬失重+姜黃素組(MG+CUR，4μM)。實(shí)驗(yàn)組加入姜黃素（4μM）共同模擬微重力條件下培養(yǎng)96h后，檢測(cè)細(xì)胞中ROS產(chǎn)量及培養(yǎng)液中OPG和RANKL含量;用pRT-PCR(Quantitative real-time PCR analysis)法結(jié)合WesternBlot法檢測(cè)VDR的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組加入姜黃素（4μM）共同培養(yǎng)7天后，檢測(cè)ALP

7、活力水平。然后綜合評(píng)估微重力條件對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖及分化功能的影響，并探討姜黃素在其中發(fā)揮的作用及其機(jī)制。
　　2.旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS，Rotary cell culture system）模擬體外微重力條件，體外培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞。根據(jù)不同處理方法將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為五組(1)1g重力組(Con)(2)模擬失重組(MG);(3)模擬失重+1,25-二羥維生素D組(MG+1,25D,10 nM);(4)模擬失重+

8、姜黃素組(MG+curcumin，4μM)(5)模擬失重+1,25-二羥維生素D+姜黃素組(MG+1,25D+ curcumin，4μM和10 nM)。同方法1,檢測(cè)ROS、 ALP和RANKL/OPG，對(duì)比分析姜黃素與1,25D對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞代謝和分化的影響.
　　結(jié)果：
　　1.MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con)，模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)液

9、中ROS含量升高了48.2％(p=0.002)，而模擬微重力+姜黃素組(MG+CUR)與單純模擬微重力組(MG)組相比ROS水平下降了26.6％(p=0.014)。
　　2.MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于相比于正常重力組(Con)，模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)液中OPG產(chǎn)量下降了17.5％(p＜0.001)，而MG+CUR組與MG組相比OPG產(chǎn)量升高了19.9％(p＜0.001

10、);相比于正常重力組(Con)，模擬微重力組(MG)組RANKL產(chǎn)量明顯增加(p＜0.001)，RANKL/OPG比值顯著升高(p＜0.001);而MG+CUR組與單純模擬微重力組(MG)組相比RANKL產(chǎn)量明顯下降(P＜0.05)，相比于單純模擬微重力組(MG）組，MG+CUR組RANKL/OPG比值明顯下降(p＜0.001)。
　　3.MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con)，模擬

11、微重力組(MG) MC3T3-E1細(xì)胞的VDR mRNA表達(dá)水平下降了68％(p＜0.001)和蛋白表達(dá)水平下降了72％(p＜0.001);而MG+CUR組與單純模擬微重力組(MG)組相比，VDR mRNA(p＜0.001)表達(dá)水平升高了194％而蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高了168％(p＜0.001)。
　　4.MC3T3-E1細(xì)胞在RWVB中孵育養(yǎng)7天后，ALP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于正常重力組(Con)，模擬微重力組(MG) MC3T3-E1細(xì)

12、胞的ALP活性明顯降低(p=0.005)，而模擬微重力+姜黃素組(MG+CUR)組與單純模擬微重力組(MG)組相比ALP活性明顯升高(p=0.020)。
　　5.同方法1處理MC3T3-E1細(xì)胞后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相比于Con組，MG組MC3T3-E1細(xì)胞ROS水平顯著升高(p=0.001)，MG組與MG+1,25D組相比無(wú)明顯差異(p=0.54);而MG+CUR組和MG+1,25D+CUR組與MG組相比ROS水平顯著下降(p=0.006

13、;p=0.001)。而MG+CUR組與MG+1,25D+CUR組相比無(wú)明顯差異(p=0.74)。
　　結(jié)論：
　　1.模擬微重力使MC3T3-E1細(xì)胞ROS水平升高，抑制細(xì)胞的增殖分化能力;而姜黃素能夠明顯減弱模擬微重力對(duì)MC3T3-E1的抑制作用，降低ROS水平，上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞VDR表達(dá)水平。
　　2.模擬微重力條件使RAW254.7細(xì)胞ROS水平升高，有利于破骨細(xì)胞生成，并使破骨細(xì)胞活力增強(qiáng)，而姜黃素能夠