生物人工肝支持系統(tǒng)中關(guān)鍵項(xiàng)目的評價技術(shù)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.pdf

1、目的：
　　1.評價生物人工肝生物反應(yīng)器中用海藻酸鈉/殼聚糖微囊(AC微囊)的安全性和預(yù)期生物功能，為制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)依據(jù)。
　　2.評價用于生物人工肝支持系統(tǒng)中肝細(xì)胞的活性、合成和藥物代謝功能;探索性考察Gal抗原缺失肝細(xì)胞與野生型動物肝細(xì)胞功能性基因表達(dá)的差異，為動物源性肝細(xì)胞用于生物人工肝的可能性評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　3.評價生物人工肝支持系統(tǒng)中血泵分離裝置的血細(xì)胞損傷（溶血性能），建立連續(xù)流血泵評價溶血性

2、試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)依據(jù)。
　　方法：
　　1.根據(jù)李蘭娟院士人工肝課題組提供的一步法制備AC微囊，并對AC微囊進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)、密度、免疫阻隔、降解性、機(jī)械強(qiáng)度和物質(zhì)通透性等進(jìn)行物理表征，通過AC微囊的細(xì)胞毒性、溶血性和熱原性進(jìn)行評價，考察其生物相容性。
　　2.采用HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，模擬其預(yù)期臨床使用方式，用AC微囊包裹肝細(xì)胞，評價將用于生物人工肝支持系統(tǒng)中肝細(xì)胞活性、合成和藥物代謝功能。采

3、用Realtime-PCR技術(shù)對Gal抗原缺失動物肝細(xì)胞與野生型動物肝細(xì)胞功能性基因表達(dá)的差異進(jìn)行評價。
　　3.在一定循環(huán)管路及血泵工作條件下，采用氰化高鐵血紅蛋白法檢測血漿中游離血紅蛋白的量，考察血泵循環(huán)動力因素對紅細(xì)胞潛在破壞作用即溶血性能評價。
　　結(jié)果：
　　1.制備AC微囊粒徑為800～1000μm，呈球狀、大小均一、SEM顯示微囊有微孔洞;密度為（1.39±0.155）g/mL。在180 r/min振蕩下

4、24h后其完整率在95％以上;微囊通透性試驗(yàn)顯示10min時人血清白蛋白釋放率約為50％，90 min左右蛋白達(dá)到了平衡狀態(tài);免疫分子無法進(jìn)入AC微囊中;模擬生物反應(yīng)器經(jīng)12h后，微囊形貌變化較小，介質(zhì)pH值隨著時間的增加而增加，特征峰的譜帶強(qiáng)度明顯減弱，說明靜電相互作用減弱，分子鍵開始發(fā)生斷裂，即作用3d的微囊發(fā)生一定程度的降解;MTT試驗(yàn)結(jié)果可以看出，用浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞相對活性為97％左右，LDH試驗(yàn)中，微囊浸提液樣品組的檢測OD值

5、為(0.381±0.035)，細(xì)胞毒性評價(MTT、LDH)的結(jié)果顯示微囊浸提液與空白組相比細(xì)胞的相對活性沒有顯著性差異。微囊浸提液內(nèi)毒素含量小于5U/mL;血液相容性評價直接法的溶血率為（1.36±0.211）％;浸提法的溶血率為（2.69±0.219）％。在8h內(nèi)微囊殘留DNA的量126 ng/mL，72 h后DNA的量約為572.122 ng/mL。
　　2.包裹的肝細(xì)胞均勻分布在微囊內(nèi)，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞生長狀態(tài)良好，死細(xì)

6、胞數(shù)目極少;微囊化肝細(xì)胞在24h內(nèi)氨代謝約為（312.43±88.16）ng/106細(xì)胞，24 h后每106個細(xì)胞的氨代謝能力逐漸增加;與未包裹的肝細(xì)胞相比其白蛋白和尿素合成量均有所提高，且隨著時間遞增微囊化培養(yǎng)的肝細(xì)胞CYP1A2活性提高約5倍，CYP3A4活性提高大于3倍;
　　3.當(dāng)iGB3S基因和GGTA1基因單敲或雙敲時中肝藥酶相關(guān)基因CYP1a1、CYP2b10、CYP3a和CYP4a14基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)藥物代謝途徑

7、，糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因ST3Gal1、ST3Ga13、ST6Gal1和Neu5Ac基因的表達(dá)上調(diào)，說明敲除型小鼠中mRNA表達(dá)反應(yīng)蛋白活性增加，仍有其他異源抗原的表達(dá)。
　　4.建立血泵裝置的溶血性評價方法，增加了氰化高鐵血紅蛋白檢測法，血泵裝置的溶血試驗(yàn)中各個時間點(diǎn)的修正溶血指數(shù)大于0.1，因此該血泵的泵速等因素可對紅細(xì)胞造成明顯的破壞作用;
　　結(jié)論：
　　1.采用一步法制備的AC微囊，具有良好的通透性和機(jī)械強(qiáng)度，具

8、有一定的免疫隔離作用，在一定時間內(nèi)無溶血性、無熱原反應(yīng)。
　　2.對微囊化的細(xì)胞采用系統(tǒng)評價方法，包括細(xì)胞毒性評價、代謝活性和藥物解毒功能評價。其結(jié)果顯示，包裹的肝細(xì)胞均勻分布在微囊內(nèi)，并且與未包裹的肝細(xì)胞相比其白蛋白、尿素合成量及P450活性均有所提高。
　　3.Realtime-PCR結(jié)果表明Gal抗原缺失型動物肝細(xì)胞的肝藥酶基因表達(dá)水平輕度上調(diào)，說明基因敲除動物肝細(xì)胞對肝藥酶無負(fù)面影響，甚至基因表達(dá)水平輕度增高，可能有

9、利于促進(jìn)藥物代謝;但也有部分基因表達(dá)下調(diào)，這也可能是在生物代謝途徑中受到多種代謝通路的調(diào)控，還有待深入研究。
　　4.在一定循環(huán)管路及血泵工作條件下，血泵循環(huán)動力因素對紅細(xì)胞具有較大的影響，對血細(xì)胞的破壞程度高，說明對血泵進(jìn)行溶血性評價至關(guān)重要;但臨床上對泵速的要求不同，還有待深入研究。
　　研究成果
　　1.對生物人工肝中使用的微囊材料進(jìn)行物理表征、生物學(xué)評價和體外細(xì)胞毒性評價，為建立生物人工肝支持系統(tǒng)中微囊化細(xì)胞培