涼血止血藥炒炭時黃酮類成分的變化規(guī)律與止血作用的相關(guān)性研究.pdf

1、中藥制炭后用于止血距今已有兩千年的歷史，因其功效顯著，至今仍廣泛用于臨床。常用炒炭止血的中藥按藥性可分為涼血止血藥、溫經(jīng)止血藥、化瘀止血藥、收斂止血藥。而“出血者屬熱者十之八九”，故臨床治療出血，以涼血止血藥應用較為廣泛。此類藥的生品清熱涼血，炒炭后止血作用增強。文獻發(fā)現(xiàn)側(cè)柏葉、蒲黃、槐花炒炭后其所含黃酮苷的含量均下降，而黃酮苷元的含量升高，說明在炒炭過程中，黃酮類成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化。但這類成分轉(zhuǎn)化與其止血作用之間是否具有相關(guān)性未見有相關(guān)研

2、究?；被?、側(cè)柏葉及蒲黃均為涼血止血藥，黃酮類成分含量均較高，且炒炭后止血作用均顯著增強，基于此，本論文提出這三種涼血止血藥在炒炭過程中黃酮類成分的轉(zhuǎn)化可能與藥物止血作用增強有關(guān)，且其止血機理可能存在共性的假說。本論文的主要內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　1、槐花、側(cè)柏葉及蒲黃總黃酮的提取及模擬炒炭方法的確定
　　論文首先以60％乙醇回流提取，采用大孔吸附樹脂法純化富集獲得三種所選止血藥槐花、側(cè)柏葉及蒲黃總黃酮。并以HPLC法測定槐

3、花、側(cè)柏葉及蒲黃總黃酮的純度，分別為95.84％、89.82％及84.79％。
　　為系統(tǒng)研究上述藥物所含黃酮類成分在炒炭加熱過程中的變化規(guī)律，將三種中藥中提取分離獲得的總黃酮部位模擬炒炭加熱處理。按照《中國藥典》規(guī)定的炒炭技術(shù)方法，并按照三種中藥的實際炒炭工藝，選擇在4種溫度下對三種藥物進行炒制，并測定藥物達到規(guī)定的炒炭程度所需時間，發(fā)現(xiàn)槐花和側(cè)柏葉在250℃下、蒲黃在200℃所需時間適中，因此將槐花、側(cè)柏葉中提取獲得的總黃酮進

4、行模擬炒炭溫度選擇以250℃為宜，而蒲黃總黃酮的模擬炒炭溫度則選擇200℃。同時，比較了三種模擬炒炭方法:總黃酮直接加熱、總黃酮+空白飲片混合加熱、總黃酮+硅藻土為載體填充條件下混合加熱對黃酮類成分變化的影響差異，結(jié)果表明三種方法對總黃酮成分變化的影響無明顯差異，考慮到以空白飲片和硅藻土為載體填充模擬炒炭加熱對黃酮類成分的損耗嚴重且操作繁瑣，故論文以總黃酮直接加熱的方法對總黃酮進行模擬炒炭。
　　2、譜效關(guān)系和柱層析聯(lián)用追蹤槐花、

5、側(cè)柏葉及蒲黃總黃酮模擬炒炭產(chǎn)物中的止血成分
　　采用HPLC-MS/MS分析方法，對槐花、側(cè)柏葉及蒲黃三種藥物的總黃酮模擬炒炭不同加熱時間產(chǎn)物進行化學組成分析，結(jié)果顯示三種藥物的黃酮類成分隨著加熱時間的延長，黃酮苷含量持續(xù)下降，黃酮苷元的含量先增加后減少，加熱到一定時間可產(chǎn)生新色譜峰。
　　采用整體動物實驗，以鼠尾出血時間(BT)、凝血四項(APTT、PT、TT、FIB)、優(yōu)球蛋白溶解時間(ELT)及ADP、凝血酶、膠原誘導

6、的血小板聚集為指標，考察黃酮類成分模擬炒炭不同加熱時間產(chǎn)物止血作用的差異，結(jié)果表明，不同加熱時間的產(chǎn)物能夠通過縮短BT、APTT、PT及促進膠原誘導的血小板聚集發(fā)揮止血作用，對其他指標無顯著性影響;止血作用呈先增強后減弱趨勢，加熱到某一時間的產(chǎn)物作用最強，槐花、側(cè)柏葉總黃酮以分別加熱10min、12min的產(chǎn)物止血作用最強。
　　依據(jù)成分分析及止血活性的研究結(jié)果，論文采用典型相關(guān)分析建立譜效關(guān)系以追蹤具有止血活性的色譜峰，研究三種

7、藥物加熱后其中黃酮類成分組成變化與止血活性增強的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)槐花總黃酮加熱產(chǎn)物中新生成的峰8、峰11及側(cè)柏葉總黃酮加熱產(chǎn)物中新生成的峰10、峰12與止血效應相關(guān)性最好，通過柱層析分離，并基于譜圖分析確定結(jié)構(gòu)，表明這些具有止血活性的新峰為新化合物，分別命名為huaicarbon A、huaicarbon B、cecarbon。槐花總黃酮模擬炒炭加熱產(chǎn)生的是huaicarbon A/B，側(cè)柏葉總黃酮模擬炒炭加熱產(chǎn)生的是huaicarbo

8、n B及cecarbon，蒲黃總黃酮模擬炒炭加熱也生成了huaicarbon A/B。通過體外促凝血實驗和血小板聚集實驗，進一步驗證了這三個新化合物能縮短APTT、PT，促進膠原誘導的血小板聚集，并呈劑量依賴性，與譜效相關(guān)性研究結(jié)果一致。三種藥物總黃酮模擬炒炭均產(chǎn)生了新化合物huaicarbon B，為其共性止血成分。
　　3、新化合物huaicarbon A/B、cecarbon在槐花炭、側(cè)柏炭、蒲黃炭中的含量測定及其止血作用研

9、究
　　采用HPLC-PDA法檢測槐花炭、側(cè)柏炭及蒲黃炭飲片中huaicarbon A/B、cecarbon成分的含量，研究結(jié)果顯示，自制的三種炭藥中均能檢測到該三種止血活性成分huaicarbon A/B、cecarbon。自制炭品因嚴格控制炮制過程，故含量較為穩(wěn)定，而市售品中含量差異極大，有些市售炭藥批次甚至不含有這三種成分。表明炒炭的炮制需嚴格控制炮制程度并會直接影響炭藥炮制品中成分的組成。
　　進一步研究考察了炒炭產(chǎn)

10、生的新化合物是否是藥物炭品發(fā)揮止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。分別大鼠灌胃給藥huaicarbon A/B以及三種藥物炭品粉末，通過大鼠體內(nèi)止血實驗，以BT、APTT、PT、TT及ADP、凝血酶、膠原誘導的血小板聚集為指標，研究huaicarbon A/B與槐花炭、側(cè)柏炭、蒲黃炭止血作用。結(jié)果表明，槐花炭、側(cè)柏炭、蒲黃炭及huaicarbon A/B均能不同程度地縮短鼠尾出血時間，縮短APTT、PT、TT及促進三種誘導劑誘導的血小板聚集發(fā)揮止血作用

11、。不含huaicarbon A/B及cecarbon的市售炭品，其止血作用顯著弱于自制炭品和含huaicarbon A/B及cecarbon的市售炭品。上述實驗結(jié)果不但驗證了huaicarbon A/B具有體內(nèi)止血作用，說明炒炭炮制工藝可直接影響炭品的體內(nèi)藥效，并且初步證實了“炒炭止血”及“炒炭存性”理論的科學性。為比較槐花炭與huaicarbon A/B止血作用的差異，huaicarbon A/B以槐花炭3組中的含量計算給藥劑量，發(fā)現(xiàn)

12、huaicarbon A/B能夠縮短BT、APTT、PT，促進膠原、凝血酶誘導的血小板聚集，與槐花炭3組比較，huaicarbon A/B的BT、APTT、PT、膠原誘導的血小板聚集均無顯著性差異，表明huaicarbon A/B是槐花炭3的主要止血藥效成分之一;而其TT和ADP、凝血酶誘導的血小板聚集有顯著性差異，表明藥物中存在其他止血成分起到協(xié)同作用。
　　4、槐花炭、側(cè)柏炭、蒲黃炭中止血成分huaicarbon A/B的前體

13、物質(zhì)尋找
　　為了探索槐花炭、側(cè)柏炭和蒲黃炭中止血成分huaicarbon A/B的轉(zhuǎn)化生成途徑，尋求其前體物質(zhì)，揭示黃酮類成分在炒炭過程中可能的轉(zhuǎn)化機制，將槲皮素（異鼠李素）與鼠李糖（葡萄糖）以不同摩爾比置于馬弗爐中進行加熱反應，采用HPLC-MS/MS對加熱反應產(chǎn)物進行分析驗證。結(jié)果表明，槲皮素與鼠李糖在250℃/200℃反應即能轉(zhuǎn)化生成huaicarbon A/B。增加鼠李糖的摩爾數(shù)能提高huaicarbon A/B的生成率

14、，槲皮素與鼠李糖加熱反應的最佳摩爾比為1∶3，此時，huaicarbon A/B的生成率分別為25％和16％。為了保證較高的轉(zhuǎn)化率，加熱溫度需控制在200℃-250℃范圍內(nèi)，加熱時間也需嚴格控制(如250℃10-15min/200℃25-30 min)。槲皮素與葡萄糖、異鼠李素與鼠李糖/葡萄糖加熱反應未能生成huaicarbon A/B。上述實驗結(jié)果表明，槲皮素和鼠李糖是huaicarbon A/B的前體物質(zhì)，它們在炒炭過程中能夠形成h

15、uaicarbon A/B。
　　5、Huaicarbon A/B、cecarbon促血小板聚集作用機制的初步研究
　　采用體外血小板聚集實驗，觀察加入GPVI受體（主要的血小板膠原受體，主要功能是介導膠原誘導的血小板內(nèi)信號轉(zhuǎn)導及血小板活化，從而引起血小板聚集）特異性抑制劑前后huaicarbon A/B、cecarbon對人血小板聚集、胞內(nèi)Ca2+水平的影響初步研究了huaicarbon A/B、cecarbon促進膠原誘

16、導的聚集的作用機制。結(jié)果表明，huaicarbon A/B及cecarbon能夠增加胞內(nèi)Ca2+的累積，促進膠原誘導的血小板聚集，而這種作用能被GPVI受體特異性抑制劑阻斷。Huaicarbon A/B及cecarbon通過激活血小板GPVI受體介導的信號通路促進膠原誘導的血小板聚集。
　　6、結(jié)語
　　論文提取分離槐花、側(cè)柏葉及蒲黃中的黃酮類成分，以此為研究對象，采用直接加熱模擬炒炭過程，考察炒炭過程中這三種藥物所含黃酮類

17、成分的變化，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)炒炭后生成了三種新成分，并且這三種新成分是其炒炭后產(chǎn)生止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一?；被?、側(cè)柏葉及蒲黃炒炭中黃酮類成分的變化存在共性規(guī)律:黃酮類成分經(jīng)加熱后黃酮苷含量下降，黃酮苷元含量先上升后下降，加熱至某一時間點轉(zhuǎn)化生成了新化合物huaicarbon A/B、cecarbon，再加熱一段時間后其含量下降，直至消失。槐花炒炭加熱過程中產(chǎn)生的是huaicarbon A/B，側(cè)柏葉炒炭加熱過程中產(chǎn)生的是huaicarbo

18、n B及cecarbon，蒲黃炒炭加熱過程中也生成了huaicarbon A/B。Huaicarbon B為槐花炭、側(cè)柏炭及蒲黃炭的共性止血成分。炒炭溫度下生成的具有止血作用的成分huaicarbon A/B可能是由三種藥物本身含有的槲皮素和鼠李糖在加熱過程中生成。論文揭示了黃酮類成分與涼血止血藥槐花、側(cè)柏葉及蒲黃炒炭后產(chǎn)生止血作用的相關(guān)性，并從共性成分、共性效應的角度，揭示了涼血止血藥槐花、側(cè)柏葉及蒲黃炒炭止血、炒炭存性的科學內(nèi)涵，為