基于高通量測序研究基底硬度與轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1對肝細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：基于高通量測序技術(shù)，探究基底硬度的變化與TGF-β1對人正常肝細(xì)胞（L02）細(xì)胞功能的影響，從而研究肝細(xì)胞生物行為與肝纖維化進(jìn)程的關(guān)系，為治療肝組織病變提供新的視角。
　　方法：以聚乙烯醇水凝膠（PVA）為基底膜，構(gòu)建與正常肝組織（4.6 kPa）、肝纖維化早期（19 kPa）、肝纖維化中后期（37 kPa）肝臟組織硬度相當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)模型；在不同硬度PVA膜上培養(yǎng)L02細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同硬度PVA膜上細(xì)胞凋亡比率；

2、基于高通量測序技術(shù)篩選不同硬度基底與TGF-β1協(xié)調(diào)作用下的差異表達(dá)基因；運(yùn)用免疫熒光技術(shù)檢測不同硬度基底膜上TGF-β1組與對照組細(xì)胞形態(tài)和骨架構(gòu)象的變化，采用 RT-PCR和 Western-Blot技術(shù)檢測 E-cadherin、Bata-catenin、Alpha-SMA、Vinculin、Integrinβ1、Collagen-1的基因及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：構(gòu)建了硬度可控（4.6kPa、19kPa、37kPa）的P

3、VA膜的體外培養(yǎng)模型；L02細(xì)胞在PVA膜上培養(yǎng)48小時可呈現(xiàn)融合生長，不同硬度PVA膜上細(xì)胞的凋亡率均低于10％，且隨著硬度的增加，細(xì)胞凋亡程度下降，證明PVA水凝膠作為細(xì)胞培養(yǎng)基底膜具有優(yōu)良的生物學(xué)相容性，適用于L02細(xì)胞的體外培養(yǎng)；細(xì)胞球形指數(shù)隨基底硬度的增加而變大，說明基底硬度增強(qiáng)了細(xì)胞的形變能力；測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)， TGF-β1組和對照組在細(xì)胞骨架、粘附等相關(guān)方面的基因表達(dá)差異顯著，結(jié)合前期研究，篩選出差異基因E-cadherin

4、、Bata-catenin、Alpha-SMA、Vinculin、Integrinβ1、Collagen-1；免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明隨著基底硬度的增加細(xì)胞骨架發(fā)育能力增強(qiáng)，且在硬基底上出現(xiàn)明顯的纖維束和偽足，在4.6kPa的軟基底上，TGF-β1組和對照組的細(xì)胞骨架構(gòu)象并無明顯變化，但在19kPa和37kPa較硬基底上，TGF-β1促進(jìn)了骨架的發(fā)育；基因和蛋白方面的檢測結(jié)果表示，隨著硬度的增加， E-cadherin、beta-Catenin

5、表達(dá)量下降，Integrinβ1表達(dá)量增加，說明其細(xì)胞粘附系統(tǒng)發(fā)生了變化， TGF-β1激活整合素系統(tǒng)加劇了這一變化；Collagen-1、Alpha-SMA的表達(dá)量在TGF-β1組隨著基底硬度的增加而顯著增加，表明TGF-β1促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞的EMT過程，在肝纖維化胞外基質(zhì)膠原沉積中發(fā)揮著重大作用。
　　結(jié)論：本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基底硬度的改變影響細(xì)胞的生物力學(xué)特性和生物功能，硬度的增加增強(qiáng)了TGF-β1對細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，從理化協(xié)同作