pcDU6質(zhì)粒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-,1-shRNA抑制人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-,1-的表達(dá).pdf

1、目的:構(gòu)建能表達(dá)TGF-β<,1> shRNA的pcDU6質(zhì)粒載體.研究puDU6質(zhì)粒載體介導(dǎo)的TGF-β<,1> shRNA對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞TGF-β<,1> 表達(dá)的影響,并比較TGF-β<,1> shRNA與反義TGF-β<,1> shRNA對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞TGF-β<,1>表達(dá)的抑制作用.方法:構(gòu)建TGF-β<,1> shRNA的pcDU6質(zhì)粒載體,首先從TGF-β<,1> 基因中篩選出2個(gè)21個(gè)堿基大小的片段,分別設(shè)計(jì)2對(duì)寡核苷

2、酸,第1對(duì)退火后形成雙鏈,兩端帶有ApaI和BamHI酶切位點(diǎn),第2對(duì)寡核苷酸退火后形成雙鏈,兩端帶有BamHI和HindIII酶切位點(diǎn),將上述兩對(duì)寡核苷酸依次連入pcDU6載體(帶有U6啟動(dòng)子的pcDNA3.1(-)載體).其2對(duì)DNA雙鏈通過BamHI酶切位點(diǎn)連接后形成中間由6個(gè)堿基序列間隔的反向互補(bǔ)序列,構(gòu)建成能產(chǎn)生TGF-β<,1> shRNA的質(zhì)粒載體.采用胰蛋白酶消化法從人腹膜組織中分離出腹膜間皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),并建立穩(wěn)定

3、的腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)模型.然后將表達(dá)TGF-β<,1> shRNA的pcDU6質(zhì)粒載體和表達(dá)反義TGF-β<,1> RNA的pcDNA3.1(-)的質(zhì)粒載體分別采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染進(jìn)入高糖(4.25％葡萄糖)和細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激下的第3代人腹膜間皮細(xì)胞.HPMCs中TGF-β<,1> mRNA的表達(dá)采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-PCR,RT-PCR)半定量分析.HPMCs培養(yǎng)液中TGF-β<