金黃色葡萄球菌中基于dCas9的基因敲低系統(tǒng)的構建與應用.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起人畜機會性感染的一類重要病原體。它在環(huán)境中以及人體皮膚和粘膜表面都普遍存在，能引發(fā)多種高發(fā)病率和高死亡率的感染性疾病，嚴重危害人類健康。對金黃色葡萄球菌的分子遺傳學研究能解析其毒性，致病性與耐藥性相關的分子機理，有助于發(fā)現針對其感染性疾病的新的藥物靶點和治療手段。但金黃色葡萄球菌中現有的研究特定基因功能的遺傳學操作技術都存在效率低、過程繁瑣等問題，而且一直缺乏一種簡便高效的基因敲低技術。
　　本課題中我們基于R

2、NA介導的DNA結合蛋白dCas9構建了一套簡單高效的金黃色葡萄球菌基因敲低系統(tǒng)CRISPRi，通過共表達dCas9和一段引導RNA（sgRNA）就可以實現對目標基因的特異性敲低。而利用ATc誘導的啟動子控制dcas9基因的表達使得該系統(tǒng)對基因的敲低具有可誘導性。同時我們采用了一種特殊的克隆sgRNA表達框的方法，使得敲低質粒的構建十分簡便。
　　利用CRISPRi系統(tǒng)，我們實現了對金黃色葡萄球菌不同菌株中不同大小不同表達水平基因

3、的成功敲低，并證實該系統(tǒng)也能有效地用于必需基因的功能研究。同時，我們發(fā)現該系統(tǒng)也能用于對操縱子中全部或部分基因的選擇性敲低。此外，通過同時表達多個sgRNA，該系統(tǒng)可實現多個基因的同時敲低以及單個基因的多重敲低。最后我們也探究了利用RNA介導的核酸內切酶Cas9進行金黃色葡萄球菌基因組編輯的可行性，發(fā)現因為細菌自身DNA修復系統(tǒng)的低效導致Cas9并不適合用于金黃色葡萄球菌的基因組編輯。
　　CRISPRi系統(tǒng)能同時用于必需和非必需