金黃色葡萄球菌中基于dCas9的基因敲低系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起人畜機(jī)會(huì)性感染的一類(lèi)重要病原體。它在環(huán)境中以及人體皮膚和粘膜表面都普遍存在，能引發(fā)多種高發(fā)病率和高死亡率的感染性疾病，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。對(duì)金黃色葡萄球菌的分子遺傳學(xué)研究能解析其毒性，致病性與耐藥性相關(guān)的分子機(jī)理，有助于發(fā)現(xiàn)針對(duì)其感染性疾病的新的藥物靶點(diǎn)和治療手段。但金黃色葡萄球菌中現(xiàn)有的研究特定基因功能的遺傳學(xué)操作技術(shù)都存在效率低、過(guò)程繁瑣等問(wèn)題，而且一直缺乏一種簡(jiǎn)便高效的基因敲低技術(shù)。
　　本課題中我們基于R

2、NA介導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白dCas9構(gòu)建了一套簡(jiǎn)單高效的金黃色葡萄球菌基因敲低系統(tǒng)CRISPRi，通過(guò)共表達(dá)dCas9和一段引導(dǎo)RNA（sgRNA）就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的特異性敲低。而利用ATc誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制dcas9基因的表達(dá)使得該系統(tǒng)對(duì)基因的敲低具有可誘導(dǎo)性。同時(shí)我們采用了一種特殊的克隆sgRNA表達(dá)框的方法，使得敲低質(zhì)粒的構(gòu)建十分簡(jiǎn)便。
　　利用CRISPRi系統(tǒng)，我們實(shí)現(xiàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌不同菌株中不同大小不同表達(dá)水平基因

3、的成功敲低，并證實(shí)該系統(tǒng)也能有效地用于必需基因的功能研究。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)也能用于對(duì)操縱子中全部或部分基因的選擇性敲低。此外，通過(guò)同時(shí)表達(dá)多個(gè)sgRNA，該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的同時(shí)敲低以及單個(gè)基因的多重敲低。最后我們也探究了利用RNA介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶Cas9進(jìn)行金黃色葡萄球菌基因組編輯的可行性，發(fā)現(xiàn)因?yàn)榧?xì)菌自身DNA修復(fù)系統(tǒng)的低效導(dǎo)致Cas9并不適合用于金黃色葡萄球菌的基因組編輯。
　　CRISPRi系統(tǒng)能同時(shí)用于必需和非必需