頭花蓼對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎模式識(shí)別受體及胃腸激素的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)H.pylori感染以及頭花蓼治療后SD大鼠固有免疫應(yīng)答中重要的模式識(shí)別分子TLR4和DC-SIGN的蛋白和基因水平，以及胃腸激素GAS、SS mRNA表達(dá)變化，探討頭花蓼抗H.pylori可能的機(jī)制和調(diào)節(jié)和修復(fù)的作用，為臨床研究治療H.pylori感染的慢性胃炎及新藥的研發(fā)提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:（1）H.pylori SS2000的培養(yǎng)：將SS2000均勻涂布于哥倫比亞血瓊脂上，37℃三氣培養(yǎng)箱內(nèi)

2、培養(yǎng)72h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，穩(wěn)定傳代3次后進(jìn)行H.pylori鑒定；（2）建立H.pylori感染SD大鼠的慢性胃炎動(dòng)物模型：SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后，將96只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為模型組（70只）、空白組（16只）以及藥物空白組（16只），所有SD大鼠禁食不禁水12h，5g/L的NaHCO3和消炎痛混合液進(jìn)行預(yù)處理，雄鼠1.0mL/只，雌鼠0.5mL/只；灌胃后繼續(xù)禁食不禁水，6h后模型組給予1×109cfu/mL H.pylor

3、i SS2000菌液1.5mL，灌胃后禁食禁水4h，隔天灌胃，共5次，空白組及藥物空白組以等量的無(wú)菌腦心浸液肉湯代替；（3）感染動(dòng)物模型鑒定：末次灌胃結(jié)束后8w，禁食禁水24h，模型組及空白組隨機(jī)抽取6只SD大鼠進(jìn)行處死，按照洛桑標(biāo)準(zhǔn)，將胃竇黏膜進(jìn)行HE染色，觀察SD大鼠胃黏膜發(fā)生慢性炎癥改變；對(duì)SD大鼠胃黏膜進(jìn)行快速尿素酶實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌微需氧培養(yǎng)及改良W-S銀染法檢測(cè)胃黏膜H.pylori的定植。模型組SD大鼠胃黏膜呈現(xiàn)慢性炎癥病理改變并

4、有H.pylori定植，證實(shí)慢性胃炎動(dòng)物模型構(gòu)建成功；（4）藥物治療：成功造模后，將造模組分為4組（16只/組）分別進(jìn)行頭花蓼高、中、低劑量藥物連續(xù)治療2w，模型組不予治療。藥物空白組以高劑量頭花蓼給正常SD大鼠，空白組正常飼養(yǎng)。末次灌胃2w后，處死SD大鼠取其胃組織（處死前禁食禁水24h），取出胃黏膜組織胃竇部分，將其分為4份，一份裝入腦心浸液肉湯保存液中，進(jìn)行H.pylori微需氧培養(yǎng)；一份進(jìn)行快速尿素酶實(shí)驗(yàn)（試紙法）；一份裝入樣品

5、保護(hù)液中，凍存于-80℃的冰箱中，用于RNA提?。灰环莘湃肱浜玫母栺R林固定液中，進(jìn)行組織切片，用于HE染色、免疫組化等；（5）頭花蓼效果評(píng)價(jià)：H.pylori的清除率；HE染色觀察胃黏膜淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況；（6）以頭花蓼效果最好的劑量作為治療組，采用免疫組化和real-time PCR的方法檢測(cè)頭花蓼治療前后SD大鼠固有免疫應(yīng)答中重要模式識(shí)別分子DC-SIGN、TLR4的蛋白和基因水平表達(dá)變化；（7）采用原位雜交法檢測(cè)GAS（Gastr

6、in，Gas）、SS（Somatostatin，SS）的mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：（1）H.pylori SS2000鑒定：尿素酶、觸酶、氧化酶、革蘭染色觀察證實(shí)確為H.pylori SS2000；（2）接種H.pylori后8w，經(jīng)模型鑒定，HE染色結(jié)果顯示模型組SD大鼠胃黏膜均呈現(xiàn)慢性炎癥改變，胃黏膜H.pylori培養(yǎng)、胃黏膜快速尿素酶陽(yáng)性、Giemsa染色有H.pylori定植，證實(shí)H.pylori感染SD大鼠慢性胃

7、炎的動(dòng)物模型構(gòu)建成功；（3）頭花蓼治療效果：經(jīng)SD大鼠胃黏膜H.pylori培養(yǎng)結(jié)果顯示，頭花蓼藥物不同劑量作用以后，H.pylori的定植密度有不同程度的降低，頭花蓼高劑量組（172.29mg浸膏/mL）清除率為91.573％，頭花蓼中劑量組（57.43mg浸膏/mL）清除率為78.200%，頭花蓼低劑量組（19.14mg浸膏/mL）清除率為76.327%；頭花蓼不同劑量對(duì)胃黏膜的炎癥改善情況有所不同；（4）免疫組化結(jié)果顯示，TLR4

8、、DC-SIGN主要在胃黏膜上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)，在空白組中，上皮細(xì)胞構(gòu)成規(guī)則的腺體，未見(jiàn)表達(dá)，模型組中， TLR4、DC-SIGN表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，H.pylori上調(diào)了TLR4、DC-SIGN的表達(dá)水平，分別上調(diào)1.6倍和3.2倍(P＜0.01)，經(jīng)頭花蓼治療后的，陽(yáng)性表達(dá)減弱，分別下調(diào)了1.33倍和2.6倍（P＜0.01），頭花蓼空白組與空白組相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05；（5） real-time PCR結(jié)果顯示：H.pylori

9、刺激后,模型組的TLR4 mRNA和DC-SIGN mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)，分別是2.7倍和3倍(P＜0.05)，經(jīng)頭花蓼作用后，TLR4 mRNA與DC-SIGN mRNA的表達(dá)水平有明顯的下調(diào)趨勢(shì)(P＜0.05)，分別為1.97倍和1.76倍，空白組與藥物空白組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；（6）原位雜交顯示：感染H.pylori后GAS表達(dá)明顯升高，陽(yáng)性表達(dá)較空白組多，通過(guò)掃描灰度值計(jì)算GAS光密度值顯示上調(diào)1.26倍（P＜0.01），SS表達(dá)明