表皮生長因子受體在血流動力學(xué)誘導(dǎo)顱內(nèi)動脈瘤生成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 血流動力學(xué)誘導(dǎo)兔基底動脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)譜變化的基因芯片研究
　　目的:顱內(nèi)動脈瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，動脈瘤一旦破裂，致殘致死率較高。目前對于顱內(nèi)動脈瘤的治療主要有開顱手術(shù)與血管內(nèi)治療。隨著技術(shù)的進(jìn)步，盡管治療的安全性越來越高，但是仍存在手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，探索動脈瘤的無創(chuàng)治療成為一種新的思路。要尋找無創(chuàng)治療的靶點(diǎn)就要求我們對動脈瘤的病因?qū)W開展研究。目前關(guān)于動脈瘤發(fā)生發(fā)展的主流

2、研究觀點(diǎn)認(rèn)為，血流動力學(xué)因素在其中有重要作用。關(guān)于兔顱內(nèi)動脈瘤模型的文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)扎兔雙側(cè)頸總動脈后，基底動脈在高血流負(fù)荷條件下發(fā)生了顯著重構(gòu)，但其中主要的細(xì)胞成分平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells，SMCs)發(fā)生了怎樣的改變并不清楚。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)，對基底動脈SMCs在血管重構(gòu)過程中基因表達(dá)譜進(jìn)行研究，探討血管在血流負(fù)荷下重構(gòu)的生物學(xué)過程，分析表達(dá)差異的基因，為下一步的研究提供線索。
　　方法:新西蘭大白兔

3、，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，對照組暴露雙側(cè)頸總動脈。5天后將新西蘭大白兔處死，應(yīng)用生理鹽水予以心臟灌注，開顱取基底動脈標(biāo)本。應(yīng)用酶消化法，分離基底動脈SMCs。將平滑肌樣品抽提總RNA后，應(yīng)用Agilent rabbit4×44K芯片進(jìn)行檢測。然后選取部分基因應(yīng)用Real-timePCR對芯片結(jié)果的可信性進(jìn)行驗(yàn)證。最后對所得差異基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)分析及KEGG(Kyoto Encyclope

4、dia of Genes and Genomes)通路富集分析。并對差異基因中包含的轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:結(jié)扎兔雙側(cè)頸總動脈5天后可見兔基底動脈發(fā)生顯著重構(gòu)，基底動脈迂曲，直徑增大。芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)947個差異基因，其中實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，617個基因表達(dá)升高，330個基因表達(dá)降低。選取了PTHLH、ENPP1、IGF1等芯片結(jié)果提示發(fā)生改變的基因進(jìn)行了PCR的驗(yàn)證，結(jié)果顯示所有選取的基因在RNA水平上改變的趨勢與芯片的結(jié)果是一

5、致的，這也證明了芯片結(jié)果的可靠性。對差異基因進(jìn)行GO分析顯示，在血流動力學(xué)改變誘導(dǎo)兔基底動脈重構(gòu)的過程中，差異基因主要參與細(xì)胞之間的信號傳遞和細(xì)胞的發(fā)育過程;參與組成細(xì)胞內(nèi)成分、細(xì)胞膜連接的細(xì)胞器;參與蛋白的結(jié)合等功能。KEGG通路分析結(jié)果顯示，血流動力學(xué)誘導(dǎo)血管重構(gòu)時，表達(dá)下調(diào)的基因主要與精氨酸和脯氨酸代謝相關(guān);表達(dá)上調(diào)的基因主要與細(xì)胞外受體之間的相互作用、局部的粘附等相關(guān)。另外，我們發(fā)現(xiàn)血流動力學(xué)負(fù)荷誘導(dǎo)發(fā)生顯著改變的基因中，包含2

6、5個轉(zhuǎn)錄因子，它們可能參與調(diào)控基因的表達(dá)。
　　結(jié)論:兔基底動脈平滑肌細(xì)胞在高血流負(fù)荷條件下，其基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化。通過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了一些特定基因及轉(zhuǎn)錄因子可能在血流動力學(xué)誘導(dǎo)的血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分 EGFR在血流動力學(xué)誘導(dǎo)大鼠顱內(nèi)動脈瘤生成中的作用及機(jī)制研究
　　目的:本課題擬研究表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor, EGFR）對血流動力學(xué)改變誘

7、導(dǎo)大鼠顱內(nèi)動脈瘤生成的影響，并探討EGFR對動脈瘤生成中的作用機(jī)制。
　　方法:SD大鼠隨機(jī)分為4組:空白對照組、動脈瘤組、Erlotinib組（EGFR抑制劑組）、Erlotinib溶劑組。動脈瘤組、Erlotinib組及Erlotinib溶劑組大鼠，均予以結(jié)扎左側(cè)頸外動脈、左側(cè)翼顎動脈及右側(cè)頸總動脈，建立血流動力學(xué)改變誘導(dǎo)大鼠顱內(nèi)動脈瘤模型。對照組予以暴露上述血管，但不進(jìn)行結(jié)扎。2周后取空白對照組及動脈瘤組大鼠的顱內(nèi)動脈，對E

8、GFR及EGFR的激活形式磷酸化EGFR(EGFR-P)進(jìn)行Western blot檢測。建模3個月后應(yīng)用血管鑄型劑(Batson's#17)，對大鼠進(jìn)行心臟灌注，獲取顱內(nèi)動脈血管鑄型，并進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，對各組成瘤率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。于3個月時，應(yīng)用生理鹽水對大鼠進(jìn)行心臟灌注，獲取大鼠顱內(nèi)血管后提取RNA，并應(yīng)用PCR對MMP2、MMP9等動脈瘤標(biāo)記物進(jìn)行檢測。同時建模3個月后應(yīng)用生理鹽水及多聚甲醛對大鼠進(jìn)行心臟灌注，獲取大鼠大腦組

9、織，予以包埋、切片，并進(jìn)行HE染色、免疫組化和EVG染色等檢測。
　　結(jié)果:建立動脈瘤模型2周后，動脈瘤組與對照組腦血管EGFR及EGFR-P的Western blot檢測結(jié)果顯示，EGFR表達(dá)在動脈瘤組與對照組之間無明顯差異，EGFR-P在動脈瘤組表達(dá)較對照組升高。各組大鼠腦血管鑄型結(jié)果顯示:3個月時，動脈瘤組在大鼠前交通部位有明顯動脈瘤形成。Erlotinib組，動脈瘤的成瘤率較動脈瘤組低。各組血管標(biāo)本的HE及EVG染色結(jié)果顯

10、示:動脈瘤組較對照組，血管發(fā)生了顯著重構(gòu)，血管內(nèi)膜褶皺較對照組明顯，血管壁較對照組增厚。Erlotinib組血管重構(gòu)較動脈瘤組明顯減輕。免疫組化結(jié)果顯示:動脈瘤組較空白對照組，MMP2、MMP9表達(dá)明顯升高。而Erlotinib組MMP2、MMP9表達(dá)較動脈瘤組降低。Real-time PCR結(jié)果同樣顯示:動脈瘤組MMP2、MMP9表達(dá)較空白對照組升高，Erlotinib組表達(dá)較動脈瘤組降低。
　　結(jié)論:在血流動力學(xué)改變誘導(dǎo)大鼠顱