36個氨基酸多肽片段對四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化的保護性作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　肝纖維化是一種慢性進展性疾病，其特征是細胞外基質的形成和過度沉積，這些過程可使肝臟結構發(fā)生重塑。肝纖維化是多種慢性肝臟疾?。稍谠缙陔A段被逆轉）發(fā)生進展的最終共同通路，當肝纖維化嚴重到不可逆轉階段，患者發(fā)展為肝硬化和肝癌的危險性增加。因此對纖維化的早期發(fā)現(xiàn)和治療至關重要。目前，雖然在該病的診斷和治療方面取得了一些進步，但仍缺乏標準治療方案和特效治療藥物。
　　36個氨基酸多肽片段是本研究室在尋找用于肝炎診斷的生物

2、學標志物時從慢性肝炎病人血清中檢測到的，其含量較高。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)此36個氨基酸多肽片段可改變肝細胞周期，抑制細胞凋亡。
　　目前尚無此36個氨基酸多肽片段在肝纖維化小鼠模型中生理和病理作用的研究。本研究室前期發(fā)現(xiàn)36個氨基酸多肽片段對急性肝損傷和非酒精性脂肪肝都具有保護性作用，為探討該多肽片段是否對肝纖維化也具有類似的作用，故進行本項研究。本實驗采用腹腔注射四氯化碳的方法，誘導小鼠發(fā)生肝纖維化，以研究36個氨基酸多肽片段對該模型小鼠

3、的保護性作用，并探索其發(fā)揮作用的靶點和通路，為肝纖維化的治療提供實驗證據(jù)和研究方向。
　　方法：
　　1、36個氨基酸多肽片段對纖維化小鼠的保護作用
　　將50只Balb/c雄性小鼠隨機分為5組，分別為正常組、模型組、陽性藥物組、36個氨基酸多肽片段低劑量組(150μg/kg)和36個氨基酸多肽片段高劑量組(250μg/kg)。正常組通過尾靜脈分別在相應給藥時點給予注射生理鹽水；模型組腹腔注射25％CCl4，每3天1次

4、，共10次。自第4次腹腔注射CCl4后，后一天開始給予尾靜脈注射生理鹽水進行治療，共7次；陽性藥物組造模后，給予秋水仙堿灌胃治療，5次/周；兩個多肽片段治療組造模后尾靜脈注射36個氨基酸多肽片段進行治療，共7次。最后一次注射治療藥物后處死小鼠并分離血清，分別檢測各組小鼠血清ALT、AST、HA、Ⅳ-C水平，從血清學水平觀察36個氨基酸多肽片段對肝功能及纖維化程度的保護性作用。
　　2、肝組織病理學檢測
　　對各組肝組織進行病

5、理學檢測（HE染色和Masson染色），觀察其病理形態(tài)學改變和膠原纖維沉積情況，評價36個氨基酸多肽片段對肝組織的保護作用。
　　3、肝纖維化發(fā)展過程中相關基因表達水平
　　提取肝組織總RNA，采用實時熒光定量PCR的方法測定Col1A1、Col3A1、MMP-2、TIMP-1和CTGF的表達情況，分析36個氨基酸多肽片段對各組小鼠的影響情況。
　　4、肝細胞內活性氧的檢測
　　采用流式細胞術，對各組肝細胞內活性

6、氧（ROS）含量進行檢測，了解氧化應激水平。
　　結果：
　　1、各組小鼠血清酶（ALT、AST）結果
　　與正常組（31.05±2.91）相比，模型組血清ALT（45.07±5.32）水平均升高（P<0.01）；與模型組相比，秋水仙堿組（34.65±5.57）、36個氨基酸多肽片段低劑量組（36.08±2.07）、高劑量組（40.08±2.84）血清ALT水平均低于模型組（P<0.05）。模型組血清AST（85.48

7、±3.44）與正常組（62.05±10.93）相比，其水平升高（P<0.01）；秋水仙堿組（73.64±11.76）和36個氨基酸多肽片段低劑量組（71.89±11.02）AST水平低于模型組（P<0.05）。
　　2、各組小鼠纖維化指標（HA、Ⅳ-C）結果
　　模型組小鼠血清HA（291.98±39.16）比正常組（229.15±32.43）升高（P<0.05），36個氨基酸多肽片段低劑量組（240.23±25.75）血清

8、HA水平降低（P<0.05）。與正常組（79.10±30.33）相比，模型組Ⅳ-C（180.95±40.73）升高（P<0.01），36個氨基酸多肽片段低劑量組（104.55±31.77）和高劑量組（117.46±26.92）血清IV-C水平降低，與模型組具有差異（P<0.01）。
　　3、各組小鼠肝臟病理學變化情況
　　HE染色結果顯示，正常組小鼠肝組織小葉結構清晰，細胞排列整齊形成肝索，無壞死區(qū)域；模型組小鼠肝臟出現(xiàn)大面

9、積壞死，正常結構破壞，大量炎性細胞浸潤；秋水仙堿組、36個氨基酸多肽片段低劑量組和36個氨基酸多肽片段高劑量組壞死面積大大減少，僅有少量炎性細胞浸潤，其中低劑量組幾乎未見壞死區(qū)域。
　　Masson染色結果顯示，正常組小鼠肝組織內無膠原沉積，胞漿呈紅色，染色均勻；模型組小鼠肝組織正常小葉結構遭到破壞，出現(xiàn)大量異常沉積的膠原，出現(xiàn)假小葉；秋水仙堿組纖維含量減少，假小葉結構不明顯；36個氨基酸多肽片段低劑量組和36個氨基酸多肽片段高劑

10、量組纖維異常沉積明顯減少，無假小葉出現(xiàn)。
　　4、各組小鼠肝纖維化相關基因mRNA表達水平變化
　　各組Col1A1的相對表達量為：1.00，20.67±6.60，9.60±0.52，11.10±4.17，10.47±5.78（P<0.05）；Col3A1相對表達量為1.00，12.61±1.35，5.58±0.65，6.16±3.23和6.57±1.07（P<0.05）；MMP-2相對表達量為1.00，11.93±3.62

11、，5.93±2.84，5.26±1.78和5.67±2.46（P<0.05）；TIMP-1相對表達量為1.00，8.25±1.87，3.97±1.02，3.36±1.83，4.19±2.78（P<0.05）；CTGF相對表達量：1.00，3.97±2.12，1.91±1.03，1.74±0.88，2.22±1.39（P<0.05）。
　　與正常組相比，模型組Col1A1、Col3A1、MMP-2、TIMP-1和CTGF相對表達量均

12、升高（P<0.05）。與模型組相比，秋水仙堿組、36個氨基酸多肽片段低劑量組和36個氨基酸多肽片段高劑量組Col1A1mRNA水平均下降（P<0.05）；秋水仙堿組、36個氨基酸多肽片段低劑量組和36個氨基酸多肽片段高劑量組Col3A1水平降低（P<0.05）；秋水仙堿組、36個氨基酸多肽片段低劑量組和36個氨基酸多肽片段高劑量組MMP-2水平下降（均P<0.05）；秋水仙堿組和36個氨基酸多肽片段低劑量組TIMP-1水平降低（P<0.

13、05）；秋水仙堿組和36個氨基酸多肽片段低劑量組CTGF水平降低（P<0.05）。
　　5、各組小鼠肝細胞內活性氧（ROS）水平
　　模型組（859.63±337.81）細胞內ROS水平與正常組（220.33±62.69）相比高于（P<0.01）；與模型組相比，36個氨基酸多肽片段低劑量組（259.60±118.10）和高劑量組（327.20±123.63）ROS水平下降，差別具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　結論