不同來源蝦青素的分離制備及其構(gòu)效關系研究.pdf

1、蝦青素屬于類胡蘿卜素的一種，除了極強的抗氧化活性外，還具有抑制腫瘤發(fā)生和生長、抵御紫外線、代維生素A活性、增強免疫功能、改善視力等諸多生理功能。雨生紅球藻源蝦青素的功效已經(jīng)得到公認，而其他來源的蝦青素化學結(jié)構(gòu)存在差異，功效尚未闡明，其合法使用的安全性仍存在爭議，目前只能作為飼料添加劑進行使用。不同來源和結(jié)構(gòu)的蝦青素生理活性亟待闡明。本論文采用生物材料制備了反式蝦青素的一對對映體，通過體外實驗對不同來源和結(jié)構(gòu)的蝦青素生理活性進行比較研究，

2、初步探明了不同來源蝦青素的結(jié)構(gòu)和生理活性差異，為蝦青素資源進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)，為蝦青素相關功能食品和海洋藥物的開發(fā)提供了技術(shù)支持。
　　本論文的研究內(nèi)容與成果如下:
　　1、建立了雨生紅球藻中蝦青素的C30-反相高效液相色譜測定法。文中系統(tǒng)考察了皂化條件和酶解條件對蝦青素提取效率的影響，并對蝦青素異構(gòu)體的校正因子進行了計算，確立了蝦青素的定量方法。實驗條件為:藻粉經(jīng)二氯甲烷:甲醇(V∶V，1∶3)研磨、超聲提取后，于

3、0.5 mL0.1 mol/LNaOH甲醇溶液、5℃避光皂化12h以上，以甲醇、叔丁基甲基醚、1％磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，采用紫外檢測器在474 nm下測定。方法的定量限為0.5 mg/g，在0.1～5 mg·L-1時反式蝦青素的峰強度與質(zhì)量濃度的線性關系良好(r2＞0.99)，方法精密度良好，相對標準偏差為3.5％～14.7％，平均回收率范圍為94.8％～107.9％。該方法準確可靠，可實現(xiàn)對雨生紅球藻中蝦青素的準確定量分析。<

4、br>　　2、以雨生紅球藻為研究對象，建立了3S,3'S-全反式蝦青素的分離純化工藝。雨生紅球藻的蝦青素粗提物在堿濃度為0.01 mol/L時，4℃時避光充氮水解15h后，于22℃下放置3h，可完全皂化，并能有效減少反式蝦青素的異構(gòu)化。皂化后提取液首先利用液液萃取技術(shù)去除極性雜質(zhì)，然后利用低壓硅膠柱層析技術(shù)和重結(jié)晶技術(shù)制備得到純度高于96.5％的蝦青素晶體。該晶體的結(jié)構(gòu)經(jīng)HPLC-MS、NMR和手性色譜柱分析，確定為3S,3'S-全反式

5、蝦青素。
　　3、以紅發(fā)夫酵母為研究對象，建立了3R,3'R-蝦青素的分離純化工藝。利用細胞玻璃研磨器進行溶劑研磨提取，采用硅膠柱層析分離技術(shù)和結(jié)晶提純技術(shù)，制備得到的蝦青素純度高于95％。利用HPLC-APCI-MS，NMR和HPLC-UV對純化得到的蝦青素結(jié)構(gòu)進行了鑒定，確定制備的全反式蝦青素幾乎都以3R,3'R結(jié)構(gòu)存在。
　　4、利用體外實驗對比研究了蝦青素異構(gòu)體的抗氧化活性。蝦青素的異構(gòu)體均能顯著提高DPPH.自由基

6、的清除活性、還原力，抑制微粒體膜的過氧化反應和DHA的過氧化作用。全反式蝦青素的立體異構(gòu)體中內(nèi)消旋-蝦青素的抗氧化活性最低，3R,3'R-蝦青素清除自由基和還原能力最強，而3S,3'S-蝦青素對脂質(zhì)過氧化的抑制作用優(yōu)于3R,3'R-蝦青素。順式蝦青素的抗氧化能力優(yōu)于全反式蝦青素，其中13-cis蝦青素對DPPH.的清除效果和還原能力最強，9-cis蝦青素對DHA過氧化的抑制作用最強。本部分研究證實蝦青素的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)有關，順式結(jié)構(gòu)

7、蝦青素的抗氧化活性顯著高于全反式結(jié)構(gòu)，而對于全反式結(jié)構(gòu)，3R,3'R-蝦青素和3S,3'S-蝦青素的抗氧化活性均高于內(nèi)消旋-蝦青素。紅發(fā)夫酵母和雨生紅球藻源的蝦青素具有更高的抗氧化活性。
　　5、采用脾淋巴細胞增殖實驗、巨噬細胞吞噬實驗和乳酸脫氫酶釋放測定法，對比研究了蝦青素異構(gòu)體之間免疫活性的差異。結(jié)果表明，3種全反式蝦青素的立體異構(gòu)體均能顯著促進小鼠脾淋巴細胞的增殖、小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力和NK細胞對靶細胞的殺傷作用，3S