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文檔簡介
1、目的:
本研究主要包括三部分內(nèi)容:1.青蒿琥酯對RANKL誘導的破骨細胞及小鼠去卵巢骨質疏松的影響;2.青蒿琥酯對RANKL誘導的破骨細胞作用機制;3.青蒿琥酯對LPS誘導的破骨細胞及小鼠急性骨破壞的影響和作用機制。
實驗方法:
1.通過MTT法考察3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯于8h、24 h、48 h、7d對RAW264.7細胞的毒性,以確定其體外實驗濃度。利用RAW264.7細胞和骨髓來源
2、的巨噬細胞(BMMs)兩種細胞建立體外RANKL誘導的破骨細胞培養(yǎng)體系,通過TRAP染色法考察3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯對RANKL誘導RAW264.7細胞和BMMs轉化成破骨細胞的影響并以Real-time PCR檢測破骨細胞相關基因c-Src、Fra-2、TRAP、β3-Integrin、Cathepsin K、MMP-9、DC-STAMP和Atp6v0d2等mRNA表達水平進行驗證,以驗證青蒿琥酯對破骨細胞生成和骨
3、吸收功能的影響。利用Osteo Assay Surface96-well Plate板通過骨吸收陷窩實驗評價3.125、6.25和12.5μM濃度的青蒿琥酯對RANKL誘導的破骨細胞破骨活性的影響。
2.青蒿琥酯抑制RANKL誘導的破骨細胞生成的作用機制。首先采用Real-time PCR、Western blot和熒光素酶報道基因技術,分別檢測NFATc1轉錄基因的mRNA、NFATc1蛋白和熒光素酶報道基因表達水平變化,從
4、三個不同側面考察青蒿琥酯對核轉錄因子NFATc1活化的影響。Western blot檢測青蒿琥酯對RANKL誘導的NF ATc1信號通路上游蛋白鈣調(diào)磷酸酶表達的影響。通過以Fluo-3/AM作為Ca2+探針的confocal技術考察青蒿琥酯對200s內(nèi)RANKL誘導的細胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響。利用Western blot技術檢測青蒿琥酯對RANKL誘導的PLCγ1磷酸化的影響。通過Real-time PCR和Western blot
5、技術檢測青蒿琥酯對RANKL/RANK信號通路上游信號分子RANK、TRAF6表達的影響。最后通過熒光素酶報道基因技術檢測RANKL刺激RAW264.7細胞NF-κB報告基因表達變化,以考察青蒿琥酯對NF-κB轉錄活性的影響。
3.建立體外LPS誘導RAW264.7細胞的破骨細胞培養(yǎng)體系,通過TRAP染色法考察青蒿琥酯在3.125、6.25和12.5μM濃度下對LPS誘導RAW264.7細胞轉化成破骨細胞的影響;采用Real-
6、time PCR技術,檢測3.125μM和12.5μM濃度的青蒿琥酯對LPS誘導的RAW264.7細胞向破骨細胞轉化過程中破骨細胞相關因子Fra-2、TRAP、β3-Integrin、Cathepsin K、DC-STAMP和Atp6v0d2等mRNA表達水平的影響,以進一步證實青蒿琥酯對破骨細胞生成的影響。通過ELISA技術檢測不同濃度的青蒿琥酯(3.125、6.25和12.5μM)對體外LPS誘導RAW264.7細胞釋放TNF-α的
7、影響。建立LPS誘導的小鼠急性骨破壞模型:分別于第0d和第4d腹腔注射LPS5 mg/kg建立模型,腹腔注射青蒿琥酯10mg/kg/d進行藥物干預,共8d。通過考察對模型動物骨參數(shù)(骨礦物質密度、骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)量和骨小梁分離度)及血清中TNF-α等指標的影響,評價青蒿琥酯對炎癥性骨破壞的影響。
結果:
1.MTT實驗發(fā)現(xiàn)除12.5μM青蒿琥酯干預24h、48 h、7d(生存率分別為分別為94.55%,P<0.0
8、5;85.61%,P<0.05和91.60%,P<0.05)外,0-12.5μM青蒿琥酯7d內(nèi)對RAW264.7細胞無明顯影響。通過TRAP染色實驗發(fā)現(xiàn)3.125μM(P<0.01)、6.25μM(P<0.001)和12.5μM(P<0.001)青蒿琥酯能夠顯著抑制體外RANKL誘導RAW264.7細胞分化成破骨細胞,并且呈劑量依賴性(F=124.566,P<0.001);與對RAW264.7結果一致,青蒿琥酯劑量依賴性地抑制RANKL
9、誘導BMMs分化成破骨細胞(=79.919,P<0.001)。通過骨吸收陷窩實驗發(fā)現(xiàn)3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯能濃度依賴性地顯著減少骨陷窩面積(F=50.855,P=0.003)。通過Real-time PCR實驗發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠濃度依賴性地顯著抑制RANKL誘導的破骨細胞相關基因c-Src(F=245.807,P<0.001)、Fra-2(F=102.631,P<0.001)、β3-Integrin(F=21.97,P
10、<0.001)、 Cathepsin K(F=510.220,P<0.001)和MMP-9(F=88.322,P<0.001)等mRNA表達水平上升,12.5μM濃度還對TRAP(F=403.031,P<0.001)、DC-STAMP(F=23.369,P=0.001)和Atp6v0d2(F=427.932,P<0.001)的mRNA表達水平。
2.對RANKL誘導的破骨細胞作用機制研究發(fā)現(xiàn),青蒿琥酯3.125(P<0.001
11、)和12.5μM(P<0.001)濃度均能濃度依賴性地顯著抑制RANKL誘導的NFATc1基因水平上調(diào)(F=123.524,P<0.001);青蒿琥酯3.125-12.5μM濃度下能濃度依賴性地顯著增加胞漿無活性形式的NFATc1即p-NFATc1蛋白的表達量,同時也能濃度依賴性地顯著抑制細胞核內(nèi)NFATc1蛋白的表達,即青蒿琥酯能顯著抑制RANKL誘導的NFATc1核轉位;青蒿琥酯(3.125、6.25和12.5μM)與陽性對照藥Cs
12、A(1μM)均能顯著降低RANKL誘導的NFAT熒光素酶報告基因表達上升(F=26.590,P<0.001)。上述三個不同層面的實驗結果提示,青蒿琥酯能抑制核轉錄因子NFATc1的活化。青蒿琥酯在3.125-12.5μM濃度下顯著抑制RANKL對NFATc1信號通路上游分子PP2B-Aα蛋白的上調(diào)。3.125和12.5μM青蒿琥酯濃度依賴性地顯著降低細胞內(nèi)Ca2+濃度(F=19.570,P<0.001),特別是12.5μM青蒿琥酯與陽性
13、對照藥CsA降低細胞內(nèi)Ca2+濃度的作用接近于空白對照組。3.125-12.5μM青蒿琥酯濃度依賴性地抑制RANKL誘導的Ca2+信號通路上游分子p-PLCγ1蛋白水平的上調(diào)。青蒿琥酯濃度依賴性抑制RANKL/RANK信號通路上游信號分子TRAF6基因(F=41.395,P<0.001)和蛋白表達;12.5μM青蒿琥酯能顯著抑制上游信號分子RANK基因表達(F=30.819,P<0.001)。陽性對照藥NF-κB抑制劑BAY11-708
14、2在5μM濃度下能顯著抑制RANKL誘導的NF-κB報告基因表達上升,抑制率約50%(P<0.05)。但是,但是,僅50μM濃度(P<0.05)的青蒿琥酯對RANKL誘導的NF-κB報告基因表達上升呈現(xiàn)抑制效應,3.125-25μM濃度下未見抑制效應。提示青蒿琥酯可能不是通過抑制NF-κB信號通路來影響OCs的生成與骨吸收功能。
3.通過TRAP染色實驗發(fā)現(xiàn)3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯能夠顯著抑制體外LPS誘導R
15、AW264.7細胞分化成破骨細胞,并且呈濃度依賴性(F=67.221,P<0.001)。3.125、6.25和12.5μM青蒿琥酯能濃度依賴性地顯著抑制OCs培養(yǎng)液中LPS誘導的TNF-α上調(diào)(F=117.712,P<0.001)。3.125μM和12.5μM青蒿琥酯顯著抑制LPS誘導的破骨細胞前體RAW264.7細胞的Fra-2(F=17.440,P<0.001)、TRAP(F=40.550,P<0.001)、Cathepsin K(
16、F=26.400,P<0.000)、DC-STAMP(F=12.870,P=0.002)和Atp6v0d2(F=161.500,P<0.001)等mRNA表達水平上升,12.5μM濃度還對β3-Integrin的mRNA表達水平具有顯著抑制效應(F=30.900,P<0.001)。通過Micro-CT掃描分析小鼠股骨的影像學特征,發(fā)現(xiàn)10mg/kg青蒿琥酯能顯著恢復LPS誘導的急性骨破壞模型小鼠骨量降低;通過分析小鼠股骨骨參數(shù)發(fā)現(xiàn),10
17、mg/kg青蒿琥酯能顯著升高小鼠骨礦物質密度(F=7.217,P=0.014)、骨體積分數(shù)(F=6.621,P=0.017)、骨小梁數(shù)量(F=6.561,P=0.018),降低骨小梁分離度(F=5.778,P=0.024);10 mg/kg青蒿琥酯能顯著降低LPS誘導的小鼠血清中TNF-α含量(F=10.85,P=0.004)。
結論:
1.青蒿琥酯能夠顯著抑制體外RANKL和LPS誘導破骨前體細胞分化形成破骨細胞,
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