青蒿琥酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的慢性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜的慢性進(jìn)展性炎癥為特征，并可出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞、畸形，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失。由于RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，至今仍無根治的方法。目前認(rèn)為炎癥細(xì)胞因子和新生血管生成在RA的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究提示，抑制炎癥細(xì)胞因子和阻斷新生血管過度形成是RA治療的有效手段。 青蒿琥酯(artesuante，

2、ART)是青蒿素的一種衍生物。近年青蒿素及其衍生物已成為治療重癥及氯喹抵抗型瘧疾最為安全和有效的藥物。近年越來越多的證據(jù)表明，除了抗瘧作用外，這些復(fù)合物亦具有免疫調(diào)節(jié)以及抗炎、抗新生血管生成的潛在作用。但青蒿琥酯對(duì)RA的治療作用及其機(jī)制目前尚不清楚，為此，本文擬通過選用wistar大鼠和RA患者原代成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-likesyoviocyte，F(xiàn)LS)為主要材料，以膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induce

3、darthritis，CIA)大鼠和TNF-α刺激成纖維滑膜細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥和VEGF表達(dá)為主要模型，采用免疫印跡、細(xì)胞免疫熒光、ELISA等。 研究方法：觀察ART對(duì)CIA大鼠的治療作用以及對(duì)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor’α，TNF-α)或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子分泌、炎癥信號(hào)通路活化和VEGF表達(dá)的影響，以闡明ART對(duì)實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作

4、用及其分子機(jī)制，為今后臨床上應(yīng)用ART治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ) 第一部分青蒿琥酯對(duì)膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎的治療作用 目的:觀察ART對(duì)膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀、滑膜病理變化的改善作用 方法:25只體重70～90克的雄性Wistar大鼠，隨機(jī)選取5只做正常對(duì)照，其余用牛Ⅱ型膠原乳劑造模。模型成功后隨機(jī)分為兩組，一組為ART組，腹腔注射100g/kg/d的ART，另一組為CIA模型組，注射等劑量的生理

5、鹽水。正常對(duì)照組大鼠處理同CIA模型組。觀察三組大鼠一般情況、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)(AI)積分、病理形態(tài)學(xué)改變和滑膜組織血管生成等情況。隔天記錄大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分；每周測體重，治療兩周后處死大鼠，用HE染色法觀察各組踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)血改變。 結(jié)果： 1、模型組大鼠精神欠佳，飲食減少，體毛無光澤，治療組未見以上情況。模型組體重增長緩慢，治療組大鼠體重增長較模型組明顯，差異有顯著性(p<0.05)。 2、CIA大鼠關(guān)節(jié)炎體征于

6、注射膠原后11～13天開始出現(xiàn)，大鼠踝關(guān)節(jié)、跖趾關(guān)節(jié)發(fā)紅、腫脹，并逐漸加重。與注射生理鹽水的模型組比較，ART治療組關(guān)節(jié)腫脹程度明顯減輕，關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)也顯著降低。 3、正常大鼠滑膜組織未見明顯的新生血管及炎癥細(xì)胞浸潤，無滑膜增厚；模型組出現(xiàn)明顯血管增生、滑膜增厚、水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤以及軟骨和骨的明顯破壞；ART治療組可見少量新生血管及炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜輕度增厚，未見軟骨和骨質(zhì)破壞。與模型組比較，治療組滑膜病理評(píng)分和血管增生指

7、數(shù)均顯著降低(p<0.05)。 結(jié)論： 1、牛Ⅱ型膠原乳劑皮下注射wistar大鼠能成功復(fù)制CIA動(dòng)物模型。 2、ART明顯改善CIA大鼠臨床癥狀、滑膜病理改變。 第二部分青蒿琥酯對(duì)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子及相關(guān)信號(hào)通路的影響。 目的：觀察人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中，青蒿琥酯對(duì)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8合成的影響，并進(jìn)一步研究這一復(fù)合物調(diào)

8、控細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制。 方法： RA FLS來源于活動(dòng)性RA患者，用TNF-α刺激并與青蒿琥酯共同孵育，ELISA測定IL-1β、IL-6及IL-8的水平，NF-κ B核移位用激光共聚焦顯微鏡檢測，western blot用來檢測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)和NF-κ B活性，用MTT法檢測RA FLS活性。 結(jié)果： 1、用MTT法檢測培養(yǎng)的RA FLS的細(xì)胞活性，在本實(shí)驗(yàn)所用藥物濃度范圍內(nèi)(0.5-40

9、μ M)，青蒿琥酯不會(huì)降低細(xì)胞的存活率，提示本文觀察到的青蒿琥酯的抑制作用不是毒性作用所致。 2、青蒿琥酯可抑制TNF-α刺激的RA FLS分泌IL-1β、IL-6和IL-8，并且呈劑量依賴性。同時(shí)青蒿琥酯亦抑制LPS誘導(dǎo)的RA滑膜細(xì)胞分泌TNFα，并呈劑量依賴性。 3、青蒿琥酯單獨(dú)孵育并不影響p38 MAPK、ERK和JNK的磷酸化，而且對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的這些激酶的活化也沒有抑制作用。 4、青蒿琥酯對(duì)TNF-α

10、誘導(dǎo)的P13K/Akt通路活性具有抑制作用，同時(shí)P13K特異性抑制劑LY294002明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的FLS分泌IL-1β、IL-6及IL-8。 5、青蒿琥酯可阻止TNF-α誘導(dǎo)的NF-κ B p65核移位，且顯著抑制NF-κB活化以及I κBα磷酸化和降解。 結(jié)論： 1、青蒿琥酯抑制RA患者FLS分泌炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8。 2、青蒿琥酯可能通過NF-κB和P13K

11、/Akt通路抑制RA FLS中炎癥細(xì)胞因子分泌，而與p38 MAPK、ERK和JNK等炎性信號(hào)通路無關(guān)。 第三部分青蒿琥酯對(duì)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞VEGF合成和HIF-1α活化的影響。 目的：觀察人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中，青蒿琥酯對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的VEGF合成的抑制作用，并進(jìn)一步探討其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子機(jī)制。 方法： RA FLS來源于活動(dòng)性RA患者，用TNF-α刺激并與青蒿琥

12、酯共培養(yǎng)，Westernblot檢測HIF-1α和VEGF的表達(dá)，HIF-1α的核移位用激光共聚焦顯微鏡檢測。 結(jié)果： 1、TNF-α刺激可使FLS合成VEGF增高，并呈時(shí)間依賴性，于刺激24小時(shí)VEGF合成達(dá)最高峰。 2、青蒿琥酯顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的VEGF合成，其最佳抑制濃度為10 μM3、TNF-α刺激FLS對(duì)HIF-1α蛋白表達(dá)無影響，但可誘導(dǎo)HIF-1α活化即由胞漿向胞核移位。 3、青蒿琥酯