青蒿琥酯抗骨髓瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(multipie myeloma，MM)是一種漿細(xì)胞的惡性疾病。本研究以小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為研究對(duì)象，并通過(guò)建立耐藥細(xì)胞株及SP2/0實(shí)體瘤模型，對(duì)青蒿素衍生物青蒿琥酯(Artesunate，ART)的抗骨髓瘤的作用及其機(jī)制進(jìn)行了探討，研究分以下三部分： 第一部分青蒿琥酯對(duì)SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞的增殖抑制及凋亡促進(jìn)作用研究 目的: 觀察不同濃度的青蒿琥酯對(duì)骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的增殖抑制及促凋亡作用并

2、對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法: 利用MTT法檢測(cè)不同濃度的青蒿琥酯對(duì)SP2/0細(xì)胞的增殖抑制作用；常規(guī)Giemsa染色、DAPI熒光染色以及透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細(xì)胞的DNA梯帶；利用Annexin V/PI雙染及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯干預(yù)24、48、72小時(shí)細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期的變化；Western blotting檢測(cè)胞核中核因子kappaB(NF-κB p65)、胞漿中NF-κB抑制

3、因子(IκBa)的蛋白水平，ArraystarTM轉(zhuǎn)錄因子試劑盒檢測(cè)NF-κB p65的轉(zhuǎn)錄活性。 結(jié)果: 1.ART能抑制SP2/0細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)劑量、時(shí)間依賴性：ART作用24時(shí)后，2μg/ml組對(duì)細(xì)胞的增殖已產(chǎn)生了抑制作用，抑制率達(dá)32.97％。隨著濃度增加，ART抑制細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)，40μg/ml組抑制率達(dá)43.25％，呈劑量依賴性(P=0.0023)。隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，ART各濃度組增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。72時(shí)

4、后，2μg/ml組抑制率即達(dá)53.2％，40μg/ml組抑制率達(dá)91.86％，顯示ART對(duì)SP2/0細(xì)胞的強(qiáng)效增殖抑制作用，呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性(P=0.0000)。但在相同濃度下，其抑制SP2/0細(xì)胞增殖的作用強(qiáng)度弱于阿霉素。 2.ART作用后SP2/0細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡的形態(tài)學(xué)改變：藥物作用前細(xì)胞胞體飽滿、胞質(zhì)豐富、胞核完整均勻，DAPI染色細(xì)胞無(wú)熒光標(biāo)記，透射電鏡下染色質(zhì)細(xì)致均勻，核仁清晰，細(xì)胞器完整，細(xì)胞微絨毛清晰可見(jiàn)。無(wú)凋亡的

5、形態(tài)學(xué)改變。藥物作用后細(xì)胞明顯縮小，染色質(zhì)凝聚、邊緣化，有的呈空泡及新月?tīng)罡淖?，胞核固縮、碎裂、出現(xiàn)凋亡小體等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。透射電鏡還可觀察到細(xì)胞微絨毛消失，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不完整。 3.10μg/ml ART作用24小時(shí)后，DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)大小為180至200bp及其倍數(shù)的梯狀條帶，片斷之間呈一定間隔，這是DNA在核小體間成倍斷裂的結(jié)果，對(duì)照組細(xì)胞未出現(xiàn)DNA降解現(xiàn)象。 4 ART在2μg/ml～40μg/m

6、l濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)SP2/0細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)出明顯時(shí)間、劑量依賴性：ART作用24小時(shí)后，2μg/ml組的細(xì)胞凋亡率已有明顯增加，(與0μg/ml組比較P<0.05)，凋亡率波動(dòng)于10％～20％之間。ART作用48小時(shí)后，凋亡率波動(dòng)于50％～80％之間。40μg/ml組作用48小時(shí)后，SP2/0細(xì)胞凋亡率達(dá)78.7％(與0μg/ml組比較P<0.05)。 5 藥物處理24、48小時(shí)后收集各組細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，各濃度組

7、與0μg/ml組比較，G0/G1期細(xì)胞數(shù)目增多，G2/M+S期細(xì)胞顯著減少(P

8、、545.9±79.62。IκBα蛋白的表達(dá)增加，提示其降解減少，未經(jīng)ART處理組及10μg/mlART作用24、48、72、96h的灰度值分別為6986.47±356.96、7207.58±256.24、7936.46±126.37、8212.23±246.31、9227.30±330.12。 7 10μg/ml ART作用24、48、72、96 h后，NF-κBp65轉(zhuǎn)錄活性逐漸下降，活性抑制率分別為66.3％、68.4％、

9、76.0％、89.6％，呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性(P<0.01)，以青蒿琥酯作用96小時(shí)，SP2/0細(xì)胞活性下降最明顯。 結(jié)論: 青蒿琥酯對(duì)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞有顯著的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，其作用機(jī)制與抑制NFκB轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。體外研究顯示，青蒿琥酯是一種潛在的抗骨髓瘤藥物。 第二部分小鼠骨髓瘤多藥耐藥細(xì)胞系SP2/0/ADM的建立和青蒿琥酯逆轉(zhuǎn)耐藥作用機(jī)制研究 目的: 通過(guò)建立多藥耐藥細(xì)胞系，研究青蒿琥酯逆轉(zhuǎn)耐藥作用

10、及其機(jī)制。 方法: 通過(guò)小劑量阿霉素逐漸加量誘導(dǎo)方法建立多藥耐藥小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0/ADM；光鏡下觀察SP2/0/ADM細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算其倍增時(shí)間；流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期分布；羅丹明123排出實(shí)驗(yàn)，對(duì)P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達(dá)狀況進(jìn)行了分析；通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)其交叉耐藥譜進(jìn)行了分析；觀察ART對(duì)SP2/0/ADM細(xì)胞的增殖抑制作用，計(jì)算其IC20值；MTT實(shí)驗(yàn)就ART(IC

11、20)對(duì)SP2/0/ADM細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用進(jìn)行觀察；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)ART作用24、48、72、96h的SP2/0/ADM細(xì)胞MDR mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分析；Western blotting對(duì)10μg/ml ART作用24、48、72、96h的SP2/0/ADM細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。 結(jié)果: 1.ADM誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，大部分細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，偶見(jiàn)少量不規(guī)則細(xì)胞，胞漿顆粒增多。建立穩(wěn)定耐藥

12、細(xì)胞系后，SP2/0/ADM細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，光鏡下SP2/0/ADM細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞相似，呈單層排列生長(zhǎng)，細(xì)胞圓形、邊界清楚，大小均一，核圓形，細(xì)胞大小無(wú)明顯改變，胞漿顆?；謴?fù)正常。其倍增時(shí)間為35.28±7.56h，與親本細(xì)胞(33.84±5.68h)比較無(wú)明顯改變(P>O.05)。SP2/0/ADM細(xì)胞與親本細(xì)胞相比G0/G1無(wú)明顯改變(P>0.05)，S期細(xì)胞減少(P<0.05)G2/M期細(xì)胞增多(P<0.05)。

13、 2.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SP2/0/ADM細(xì)胞不但對(duì)阿霉素(Adriamycin，ADM)產(chǎn)生了耐藥性，耐藥指數(shù)為22.7，而且對(duì)米托蒽醌、足葉已甙、甲氨蝶呤也有不同程度的交叉耐藥，其耐藥指數(shù)分別為4.2、2.9和5.3。 3.通過(guò)羅丹明123排出實(shí)驗(yàn)對(duì)P-gp活性進(jìn)行比較，SP2/0/ADM細(xì)胞由于P-gp蛋白表達(dá)增加，進(jìn)入細(xì)胞中的羅丹明被大量排出，熒光強(qiáng)度低。SP2/0細(xì)胞中P-gp低表達(dá)，大量羅丹明累積，故熒光強(qiáng)度大

14、。 4 ART能抑制SP2/0/ADM細(xì)胞增殖，隨著藥物濃度增加，其增殖抑制作用增強(qiáng)，呈劑量依賴性(P<0.05)。計(jì)算其IC20為0.29μg/ml，我們選取0.3μg/ml行耐藥逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可增強(qiáng)阿霉素對(duì)SP2/0/ADM細(xì)胞的毒性作用，其IC50值由17.80μg/ml降至4.27μg/ml，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為4.16倍(P<0.05)。 5 青蒿琥酯作用24、48、72、96h后SP2/0/ADM細(xì)胞MDR

15、1 mRNA的表達(dá)下降，2-△△Ct分別為0.0887±0.0023、0.0556±0.0036、0.0338±0.0031、0.0186±0.0014，各組之間的差異具有顯著性(P<0.05)，呈時(shí)間依賴性。 6 Western blotting顯示，隨著ART作用時(shí)間的延長(zhǎng)，SP2/0/ADM細(xì)胞P-gP蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。未加ART組及ART作用24、48、72、96h各組，其灰度值分別為6568.23±156.95、

16、4459.13±297.12、4218.31±153.25、3558.58±241.32、3024.83±157.35(P<0.05)。 結(jié)論: SP2/0/ADM細(xì)胞為穩(wěn)定的多藥耐藥細(xì)胞株；青蒿琥酯能逆轉(zhuǎn)SP2/0/ADM細(xì)胞的多藥耐藥，通過(guò)抑制MDR1/P-gP基因表達(dá)是其作用機(jī)制之一。 第三部分青蒿琥酯抑制血管新生的實(shí)驗(yàn)研究 目的: 對(duì)青蒿琥酯抑制血管新生的作用進(jìn)行觀察并探討其機(jī)制 方法: 通過(guò)三維

17、血管模型觀察青蒿琥酯對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性的影響：利用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型，觀察青蒿琥酯對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響；通過(guò)建立SP2/0小鼠實(shí)體瘤模型，觀察青蒿琥酯對(duì)移植瘤抑制效應(yīng)；CD34免疫組化觀察青蒿琥酯對(duì)SP2/0小鼠移植瘤血管密度的影響；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)瘤組織中VEGF mRNA的表達(dá)水平；Western blotting檢測(cè)瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)論: 體內(nèi)研究顯示ART能抑制SP2/0實(shí)體