鈍刺血蜱共生菌和肩突硬蜱病原菌的研究.pdf

1、蜱是專性吸血的體外寄生節(jié)肢動(dòng)物，其寄生宿主種類廣泛，易獲得多種病原菌，且廣泛傳播，引發(fā)疾病，對(duì)人類和野生動(dòng)物的健康以及畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重危害。同時(shí)，蜱體內(nèi)也寄生多種共生菌，與宿主的生命活動(dòng)密切相關(guān)。鈍刺血蜱Haemaphysalis doenitzi是體外寄生的三宿主蜱，主要分布在中國(guó)、日本、緬甸、老撾、印度、泰國(guó)、馬來西亞和澳大利亞等地，寄生在鳥類及小型哺乳動(dòng)物體表，可攜帶多種病原菌。肩突硬蜱Ixodes scapularis，在全世

2、界廣泛分布，主要集中在美國(guó)東北部和中部，是伯氏疏螺旋體、嗜吞噬細(xì)胞無形體和微小巴貝蟲3種病原體的主要傳播媒介，被認(rèn)為是美國(guó)公共衛(wèi)生領(lǐng)域最重要的蜱種之一。
　　本論文以鈍刺血蜱和肩突硬蜱為研究對(duì)象，運(yùn)用分子生物學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)、形態(tài)學(xué)以及行為學(xué)等方法，對(duì)鈍刺血蜱體內(nèi)共生菌的種類、生物學(xué)特性和數(shù)量動(dòng)態(tài)以及肩突硬蜱的探尋行為和其體內(nèi)伯氏疏螺旋體感染率進(jìn)行分析。本研究不僅豐富了蜱類共生菌資源，加深了對(duì)共生菌特性和功能的了解，初步反映了病原菌

3、與宿主蜱行為的關(guān)系，而且也為進(jìn)一步研究蜱類共生菌與宿主之間的共生機(jī)制和探索蜱類與病原體相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)，并最終為開發(fā)新的防治技術(shù)提供理論依據(jù)。本論文主要研究結(jié)果如下:
　　1、通過細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫(kù)構(gòu)建及PCR-RFLP分析，檢測(cè)到野外采集的鈍刺血蜱體中主要的微生物有鞘氨醇單胞菌Sphingomonas不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter和一種新的Francisella-like共生菌(FLEs-Hd)。通過系統(tǒng)

4、發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)FLEs-Hd共生菌與邊緣璃眼蜱Hyalomma marginatum marginatum和血紅扇頭蜱Rhipicephalus sanguineus體內(nèi)的Francisella-like共生菌的親緣關(guān)系較近。
　　2、運(yùn)用診斷PCR和透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)檢測(cè)并分析了共生菌的生物學(xué)特性，結(jié)果顯示，F(xiàn)LEs-Hd在野外采集的雌雄蜱中的感染率均為100％，在宿主中可進(jìn)行穩(wěn)定的垂直傳遞，不能進(jìn)行水平傳遞，在雌蜱的

5、卵巢、馬氏管、唾液腺和中腸組織中均有分布，不具有組織特異性，由此確定FLEs-Hd是鈍刺血蜱的主要共生菌。
　　3、運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real time-qPCR)技術(shù)檢測(cè)并分析了FLEs-Hd共生菌在鈍刺血蜱整個(gè)發(fā)育階段中的密度動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示，F(xiàn)LEs-Hd在卵中密度高于幼蜱和若蜱階段，而低于成蜱階段，說明FLEs-Hd在宿主中進(jìn)行垂直傳遞時(shí)存在明顯的“瓶頸效應(yīng)”。在幼蜱，若蜱和雄蜱從饑餓期到飽血期的過程中，飽血后共生菌的

6、密度均高于饑餓期，表明FLEs-Hd可能與宿主的飽血過程相關(guān)。在饑餓雌蜱中，F(xiàn)LEs-Hd的密度在吸血前一天達(dá)到最大值，說明FLEs-Hd可能與雌蜱吸血繁殖活動(dòng)的進(jìn)行密切相關(guān)。
　　4、運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)并分析了FLEs-Hd共生菌在宿主繁殖期不同組織中的密度動(dòng)態(tài)，結(jié)果顯示，F(xiàn)LEs-Hd在卵巢和馬氏管中的密度遠(yuǎn)高于中腸和唾液腺組織。在蜱吸血初期（吸血期第2天）和接近飽血前（吸血期第4天）的卵巢組織中，F(xiàn)LEs-Hd的

7、密度都處于較高水平，該共生菌密度的變化趨卵黃原蛋白合成初期迅速增長(zhǎng)，因此推斷FLEs-Hd共生菌與卵巢初期發(fā)育和宿主繁殖過程密切相關(guān)，可能為宿主提供卵巢發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或調(diào)節(jié)因子。
　　5、運(yùn)用行為學(xué)、分子生物學(xué)等方法，檢測(cè)美國(guó)北部和南部地區(qū)肩突硬蜱的探尋行為及其體內(nèi)伯氏疏螺旋體的感染率，美國(guó)北部地區(qū)的肩突硬蜱中的探尋行為較南部地區(qū)的活躍，且伯氏疏螺旋的感染率也高于南部地區(qū)，間接闡述了美國(guó)萊姆病由南向北逐漸遞增的原因。但伯氏疏螺