基于連接酶反應(yīng)的芯片實時定量PCR技術(shù).pdf

1、近幾年，基于微流控芯片技術(shù)的實時定量PCR技術(shù)由于具有高通量、低成本、低消耗等諸多優(yōu)點，正逐漸受到越來越廣泛的關(guān)注，并開始應(yīng)用于生命科學(xué)的各個研究領(lǐng)域。本論文中，我們建立了一套基于SYBR Green體系的納升級液滴陣列實時定量PCR系統(tǒng)，并且開發(fā)了一種基于連接酶反應(yīng)的PCR方法，用于檢測生物樣本中的microRNA（miRNA）表達(dá)量。該方法采用T4 RNA連接酶取代T4 DNA連接酶，減少了非特異性連接的影響，提高了檢測的特異性。通

2、過將SYBR Green熒光染料應(yīng)用于液滴型微型化實時PCR系統(tǒng)，大幅降低了系統(tǒng)成本。
　　第一章,綜述了傳統(tǒng)PCR和熒光實時定量PCR的原理與主要應(yīng)用，并對熒光標(biāo)記方法做了詳細(xì)介紹;系統(tǒng)地綜述了微流控芯片PCR的優(yōu)勢和主要類型;此外，全面介紹了檢測miRNA的常規(guī)方法與最新進(jìn)展。
　　第二章的工作中，建立了一套基于莖環(huán)探針連接反應(yīng)與SYBR Green實時定量PCR的納升級液滴陣列miRNA檢測系統(tǒng)。莖環(huán)探針連接反應(yīng)可克服

3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的缺點，且我們用T4 RNA連接酶代替了常規(guī)的T4 DNA連接酶（前者對連接位點的識別能力更強(qiáng)），并改進(jìn)了莖環(huán)探針的設(shè)計，減少了非特異性連接的影響。SYBR Green取代TaqMan探針則可大幅降低檢測成本。實驗中，我們使用mir-122作為檢測靶標(biāo)，優(yōu)化了500 nL液滴中SYBR Green的用量，在液滴陣列中實現(xiàn)了莖環(huán)探針的連接與實時PCR檢測（檢測范圍跨越6個數(shù)量級，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2達(dá)到了0.9997，擴(kuò)增效率為96.8