基于連接酶反應的芯片實時定量PCR技術.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、近幾年,基于微流控芯片技術的實時定量PCR技術由于具有高通量、低成本、低消耗等諸多優(yōu)點,正逐漸受到越來越廣泛的關注,并開始應用于生命科學的各個研究領域。本論文中,我們建立了一套基于SYBR Green體系的納升級液滴陣列實時定量PCR系統(tǒng),并且開發(fā)了一種基于連接酶反應的PCR方法,用于檢測生物樣本中的microRNA(miRNA)表達量。該方法采用T4 RNA連接酶取代T4 DNA連接酶,減少了非特異性連接的影響,提高了檢測的特異性。通

2、過將SYBR Green熒光染料應用于液滴型微型化實時PCR系統(tǒng),大幅降低了系統(tǒng)成本。
  第一章,綜述了傳統(tǒng)PCR和熒光實時定量PCR的原理與主要應用,并對熒光標記方法做了詳細介紹;系統(tǒng)地綜述了微流控芯片PCR的優(yōu)勢和主要類型;此外,全面介紹了檢測miRNA的常規(guī)方法與最新進展。
  第二章的工作中,建立了一套基于莖環(huán)探針連接反應與SYBR Green實時定量PCR的納升級液滴陣列miRNA檢測系統(tǒng)。莖環(huán)探針連接反應可克服

3、逆轉錄反應的缺點,且我們用T4 RNA連接酶代替了常規(guī)的T4 DNA連接酶(前者對連接位點的識別能力更強),并改進了莖環(huán)探針的設計,減少了非特異性連接的影響。SYBR Green取代TaqMan探針則可大幅降低檢測成本。實驗中,我們使用mir-122作為檢測靶標,優(yōu)化了500 nL液滴中SYBR Green的用量,在液滴陣列中實現(xiàn)了莖環(huán)探針的連接與實時PCR檢測(檢測范圍跨越6個數(shù)量級,標準曲線R2達到了0.9997,擴增效率為96.8

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