嗜酸氧化亞鐵硫桿菌硫同化途徑蛋白ATP硫酸化酶、APS還原酶、半胱氨酸合成酶的研究.pdf

1、本研究首先對(duì)生長(zhǎng)于不同能源培養(yǎng)基中的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的ATP硫酸化酶，APS還原酶的基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明cysD-1基因和cysH基因的表達(dá)量均存在差異，說明對(duì)生長(zhǎng)于不同能源培養(yǎng)基的這兩種酶在轉(zhuǎn)錄水平上均存在差異。 隨后克隆、表達(dá)、純化了ATP硫酸化酶，APS還原酶和半胱氨酸合成酶的基因。根據(jù)SDS-PAGE測(cè)定蛋白分子量分別為33 kDa，28 kDa，32 kDa。純化的ATP硫酸化酶蛋白溶液呈亮黃色，由紫外

2、可見光譜分析，可知其含有PLP輔助因子。據(jù)我們所知，這是首次報(bào)道ATP硫酸化酶的亞基帶有亮黃色表明其含有PLP輔基。 純化的APS還原酶為黃褐色的蛋白溶液。由紫外可見光譜及電子順磁共振結(jié)果確認(rèn)鐵硫簇是其蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)。由序列比對(duì)及分子結(jié)構(gòu)模擬，構(gòu)建了蛋白的突變體C110A，C111S，C193A，C196A，由蛋白顏色、紫外光譜及電子順磁共振結(jié)果證明這些位點(diǎn)是鐵硫簇的結(jié)合位點(diǎn)?；钚詼y(cè)定表明，其能還原APS生成亞硫酸鹽。

3、 純化的半胱氨酸合成酶呈亮黃色，由蛋白顏色及紫外可見光譜可知其含有PLP輔基，熒光分析表明其發(fā)生了由色氨酸殘基到內(nèi)部亞醛胺的外部異構(gòu)體的能量轉(zhuǎn)移。定點(diǎn)突變表明K30A，H150A，H168A是PLP的重要結(jié)合位點(diǎn)?；钚詼y(cè)定表明，硫化物與OAS在半胱氨酸合成酶的作用下生成半胱氨酸。 結(jié)合以前的研究，可以證明在嗜酸氧化亞鐵硫桿菌中，存在著以下硫酸鹽的同化途徑：硫酸鹽由ATP硫酸酶催化激活生成APS和PPi，APS又被APS還原酶還原