氧化亞鐵硫桿菌及嗜酸硫化芽孢桿菌半胱氨酸脫硫酶的分子及功能鑒定.pdf

1、氧化亞鐵硫桿菌(Acidothiobacillus ferrooxidans)在浸礦中具有重要地位，它能氧化亞鐵、硫和還原態(tài)硫化物，而且氧化亞鐵硫桿菌也是浸礦細菌研究的模式菌株。關(guān)于氧化亞鐵硫桿菌鐵硫的氧化的研究都已經(jīng)比較成熟。在實驗室前期工作中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸脫硫酶(cysteinedesulfurase IscS)在硫為唯一能源時，該基因表達上調(diào)。半胱氨酸脫硫酶(cysteine desulfurase)是一個以5-磷酸吡哆醛為輔基的二

2、聚體酶，該酶可以催化L-型半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)長-型丙氨酸生成的硫烷通過形成半胱氨酸的過硫化物，從而保護半胱氨酸殘基。
　　 為研究該蛋白在硫氧化過程中的作用，利用大腸桿菌E.coliBL21(DE3)作為替代宿主，將含半胱氨酸脫硫酶基因的質(zhì)粒pET-His-IscS，轉(zhuǎn)入E.coli BL21中使其過表達，發(fā)現(xiàn)無論是在固體培養(yǎng)基還是液體培養(yǎng)基中pET-His-IscS/BL21菌株的生長速度都比pET-His/BL21菌株的生長速度

3、快。由此可以看出半胱氨酸脫硫酶能夠促進大腸桿菌的生長。將pET-His-IscS/BL21菌株和pET-His/BL21菌株分別接種至含硫代硫酸鈉(Na2S2O3)的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)在加有2.5％的硫代硫酸鈉的LB培養(yǎng)基中，pET-His-IscS/BL21菌株能夠正常的生長，而對照菌株卻不能生長。可以看出該基因在硫的代謝中是有一定的作用的。我們推測在硫的氧化過程中，首先要打開穩(wěn)定的S8環(huán)成線性的無機硫，才能進一步的氧化，而該基因編碼的蛋

4、白在催化半胱氨酸脫去硫形成的帶有巰基的半胱氨酸殘基可以進行親核攻擊硫環(huán)從而打開硫環(huán)進行下一步氧化。進一步通過免疫共沉淀篩選到與IscS相互作用的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定該蛋白為Short-chaindehydrogenases/reductases(SDR)，進一步采用GST-pull down驗證了AF3菌IscS與SDR之間確實存在有相互作用。
　　 然而隨著礦產(chǎn)資源需求量的增加，生物冶金技術(shù)對菌的生長溫度要求越來越高，因此隨之發(fā)展

5、起來的中等嗜熱菌慢慢占為主導地位。因此本研究對嗜酸硫化芽孢桿菌(TPY)的半胱氨酸脫硫酶(cysteinedesulfurase SufS)也采用了同樣的研究方法。
　　 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶在大腸桿菌(E.coli)體內(nèi)過表達后無論是在LB固體培養(yǎng)基還是液體培養(yǎng)基同樣也可以促進該菌的生長。且通過western在蛋白分子水平上驗證了該蛋白的表達量隨著細菌生長的加快而急劇增加。將純化復性后的SufS蛋白加入LB培養(yǎng)基中也可以促進大腸桿