嗜酸氧化亞鐵硫桿菌鐵硫簇生物合成機理研究.pdf

1、生物冶金技術(shù)是一種利用微生物從礦物中提取有價金屬的經(jīng)濟方法，具有成本低、投入少、能耗低，污染小等突出優(yōu)點;針對我國有色礦產(chǎn)資源低品位、復(fù)雜、難處理的特點，生物冶金作為一種礦產(chǎn)資源高效提取的新技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。嗜酸氧化亞鐵硫桿菌是最早發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用于微生物冶金的細菌，在微生物冶金中扮演極其重要角色，其作為硫化礦生物浸出機理研究的模式菌株一直是研究的熱點。
　　 本論文以嗜酸氧化亞鐵硫桿菌A.ferrooxidans ATCC23

2、270為模板，研究了在其能量代謝過程中電子傳遞途徑里起重要作用的鐵硫簇的合成及轉(zhuǎn)運機制。以嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的ISC鐵硫簇系統(tǒng)為研究對象，克隆表達了ISC鐵硫簇生物合成系統(tǒng)的三個核心蛋白:半胱氨酸脫硫酶蛋白IscS，鐵硫簇組裝的支架蛋白IscU以及另一個鐵硫簇組裝的支架蛋白/鐵結(jié)合蛋白IscA。分別研究了它們在鐵硫簇生物合成過程中的功能和作用機理，并探討了它們在鐵硫簇的生物合成和傳遞過程中相互作用機制，以及不同氧化應(yīng)激條件下鐵硫簇生物合

3、成的差異表達;同時研究了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌硫代謝過程中催化硫酸鹽發(fā)生首步同化反應(yīng)的ATP硫酸化酶CysD1，進一步加深了對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌調(diào)控整個硫代謝途徑從硫酸鹽到半胱氨酸的電子傳遞過程cys操縱子的理解。希望通過這些工作為加深對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌鐵硫代謝途徑及電子傳遞機理的了解提供理論基礎(chǔ)。
　　 本文的研究工作主要包括以下幾個方面:
　　 (1)克隆了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC23270的isc操縱子中表達支架蛋

4、白的IscU基因，并轉(zhuǎn)入了含高效T7啟動子的pET28b表達質(zhì)粒。成功地在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了IscU，并對蛋白誘導(dǎo)條件進行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)在IPTG濃度為0.5 mM，室溫過夜的誘導(dǎo)條件下能得到較高水平重組IscU的表達。表達后的重組蛋白主要以可溶性的形式存在于細胞上清中，應(yīng)用飽和的鰲合型硫酸鎳瓊脂糖樹脂柱對含組氨酸標(biāo)簽的IscU蛋白進行了純化，得到分子量大小為16 kD的IscU蛋白，每升LB培養(yǎng)液可獲得6 mg IscU

5、蛋白。從大腸桿菌純化得到的IscU蛋白呈無色透明狀，自身不帶有鐵硫簇結(jié)構(gòu);鐵結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)IscU蛋白體外和體內(nèi)均不具備結(jié)合鐵的能力;IscU可以作為支架蛋白完成鐵硫簇的組裝，在體外添加外源鐵離子和硫離子能夠在20 min內(nèi)完成apo-IscU到[2Fe-2S]-IscU鐵硫簇的組裝。pH值對IscU上鐵硫簇的生物合成具有明顯的作用，在pH7.0-8.0時IscU可以較好的完成自身鐵硫簇的生物組裝，而當(dāng)反應(yīng)條件從pH7.0降低到6.0時，

6、IscU上鐵硫簇的生物合成受到極大的抑制。而當(dāng)pH值小于6.0時，體系中蛋白發(fā)生變性出現(xiàn)沉淀，無法完成鐵硫簇的組裝。
　　 (2)克隆了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC23270的isc操縱子中表達半胱氨酸脫硫酶的IscS基因，轉(zhuǎn)入了含T7高效啟動子的pET28b表達質(zhì)粒。成功地在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了IscS，每1升LB培養(yǎng)液可表達并純化獲得5.2 mg IscS蛋白。經(jīng)純化之后的IscS蛋白呈亮黃色，蛋白分子量為46

7、kD。對純化的IscS蛋白進行酶活測定，發(fā)現(xiàn)IscS具有較強的半胱氨酸脫硫酶活性，能催化L-半胱氨酸脫硫并把硫釋放到溶液中。加入磷酸吡哆醛能促進IscS的酶活的表達。在溫度為20-40℃之時IscS表現(xiàn)出較高的酶活性，其最適反應(yīng)溫度為37℃。而當(dāng)反應(yīng)溫度低于20℃或者高于40℃時都將極大的抑制IscS的酶活性;pH8.0為IscS酶活的最適反應(yīng)條件，在pH7.0和9.0之間IscS具有較強的酶活性，而超出這個范圍將極大的削弱IscS的酶

8、活。IscS在鐵硫簇的體內(nèi)和體外合成中都具有重要的作用， IscS可以催化L-半胱氨酸為apo-fdx體外組裝[2Fe-2S]-fdx的鐵硫簇組裝提供硫源。在LB培養(yǎng)基中加入IscS酶活抑制劑L-烯丙基甘氨酸將極大的抑制IscS酶活的表達，從而阻斷[2Fe-2S]-fdx體內(nèi)的表達。IscS能和鐵離子，半胱氨酸結(jié)合形成IscS-iron和IscS-iron-sulfur的復(fù)合物，復(fù)合物的存在將會抑制IscS半胱氨酸脫硫酶的活性。IscS

9、的酶活受到反應(yīng)體系中鐵離子和硫離子的反饋調(diào)節(jié)作用對于鐵硫簇生物合成機制的具有重要的作用。
　　 (3)克隆了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC23270的isc操縱子中的IscA基因，并構(gòu)建了pET28b-IscA表達質(zhì)粒。成功地在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了IscA，每1升LB培養(yǎng)液可表達并純化獲得7.0 mg IscA蛋白。經(jīng)純化之后的IscA蛋白呈亮黃色，蛋白分子量為11kD。從LB培養(yǎng)基中純化得到的IscA是一個含[4Fe

10、-4S]鐵硫簇的鐵硫蛋白，加入EDTA和L-半胱氨酸處理后可以除去[4Fe-4S]簇形成apo-IscA。Apo-IscA在體外具有較強的鐵的結(jié)合活性，可以結(jié)合鐵離子形成iron-loaded IscA;而iron-loaded IscA可以在IscS和L-半胱氨酸存在的情況下在體外轉(zhuǎn)化成[4Fe-4S]-IscA。以上apo-IscA，iron-loaded IscA和[4Fe-4S]-IscA三個不同狀態(tài)的IscA代表了鐵硫簇在Is

11、cA上合成時三個不同的階段。IscA蛋白中Cys35，Cys99和Cys101是其結(jié)合鐵和鐵硫簇的關(guān)鍵位點，對這三個關(guān)鍵氨基酸位點進行定點突變成丙氨酸后的IscA蛋白失去了結(jié)合鐵和鐵硫簇的能力。IscA對三價鐵具有較強的鐵結(jié)合活性，氧氣可以在IscA的鐵結(jié)合位點上通過氧化二價鐵成三價鐵而促進了IscA對鐵的結(jié)合作用。同時Iron-loaded IscA可以作為鐵供體參與支架蛋白IscU上鐵硫簇的生物組裝。
　　 (4)支架蛋白I

12、scU在低鐵離子濃度下無法完成自身鐵硫簇的生物組裝，而IscA可以競爭性的結(jié)合反應(yīng)體系中的鐵離子，并將結(jié)合的鐵離子傳遞給IscU完成IscU上鐵硫簇的組裝。L-半胱氨酸可以修飾iron-loaded IscA中鐵的活性中心，使鐵離子得以釋放到反應(yīng)體系中。同時L-半胱氨酸可以作為IscS酶活反應(yīng)的底物脫硫產(chǎn)生硫離子，而IscU可以結(jié)合iron-loaded IscA中被L-半胱氨酸修飾的鐵離子以及L-半胱氨酸脫硫產(chǎn)生的硫離子，完成[2Fe

13、-2S]鐵硫簇的組裝。對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌isc操縱子中的IscU和IscA在鐵硫簇生物合成過程中的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，IscU是一個優(yōu)先被選擇的鐵硫簇組裝的支架蛋白，而高鐵結(jié)合活性的IscA是一個優(yōu)先被選擇的鐵結(jié)合蛋白。含有鐵硫簇的支架蛋白可以把自身的鐵硫簇傳遞給apo形式的鐵硫蛋白。帶[4Fe-4S]鐵硫簇的holo-IscA可以把自身的鐵硫簇傳遞給apo-fdx和apo-APS reductase完成[2Fe-2S]-fdx和[4F

14、e-4S]-APSreductase的組裝，完成鐵硫簇傳遞后的holo-fdx和holo-APS reductase盼鐵硫蛋白具有完整的生物學(xué)活性。
　　 (5)克隆了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC23270的硫代謝途徑cys操縱子中編碼ATP硫酸化酶的CysD1基因，并構(gòu)建了pET28b-CysD1表達質(zhì)粒。成功地在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了CysD1，每1升LB培養(yǎng)液可表達并純化獲得4.3 mgCysD1蛋白。經(jīng)純化之后

15、的CysD1蛋白透明無色，蛋白分子量為33 kD。從LB培養(yǎng)基中純化得到的CysD1紫外掃描在420 nm處存在一個特征吸收峰，具有催化硫酸根離子和ATP生成APS和焦磷酸的能力，采用生物發(fā)光法測定其ATP硫酸化酶的活性為3.0×103 U/mg。對CysD1蛋白序列進行同源性比對，結(jié)合蛋白三維結(jié)構(gòu)的模擬，采用蛋白定點突變，將170位Gln，173位的Arg和211位的Asp分別突變?yōu)镾er后，紫外掃描發(fā)現(xiàn)CysD1在420 nm處的特