基于核酸適體和金納米粒子信號(hào)放大策略的電化學(xué)傳感器對(duì)鼠傷寒沙門菌的快速檢測(cè).pdf

1、食品衛(wèi)生和安全一直以來都是人類社會(huì)關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。細(xì)菌性微生物是人類和動(dòng)物食物源中最常見的病原，其中又以大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、結(jié)核桿菌、炭疽菌、肉毒梭菌、李斯特菌、豬肉鏈球菌等最為常見，占由細(xì)菌引起的食品污染95％以上。沙門氏菌屬是一類寄居在人類和動(dòng)物腸道內(nèi)抗原結(jié)構(gòu)及生化反應(yīng)相似的革蘭陰性桿菌。其對(duì)禽類產(chǎn)品、生豬肉及鮮肉制品的污染率最高，蛋類、禽類肉產(chǎn)品和豬肉是人類感染沙門氏菌病的主要渠道。鼠傷寒沙門菌屬于B群沙門氏菌，是一種

2、重要的人畜共患病原菌，其感染發(fā)病率居所有沙門菌之首，占人源沙門菌感染約40%-80%。本菌廣泛分布于自然界，宿主分布也較為廣泛，具有重要的公共衛(wèi)生意義。
　　研究發(fā)現(xiàn)，極微量濃度的鼠傷寒沙門菌即可引起各種臨床疾病，例如急性胃腸炎、敗血癥以及繼發(fā)于敗血癥的各種內(nèi)臟損害等，其多數(shù)可致病人死亡。因此，及時(shí)對(duì)致病量甚至更低濃度的鼠傷寒沙門菌的檢測(cè)是預(yù)防和治療此類死亡事件發(fā)生的重要手段，具有極其重要的臨床意義。傳統(tǒng)檢測(cè)鼠傷寒沙門菌的方法主要

3、包括細(xì)菌培養(yǎng)、生化反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、表面等離子共振技術(shù)(SPR)等。但這些方法普遍存在耗時(shí)費(fèi)力、檢測(cè)成本高、靈敏度低、不易于大規(guī)模高通量的檢測(cè)。本文介紹的基于核酸適體和金納米粒子信號(hào)放大策略的電化學(xué)傳感器可彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺陷，在4個(gè)小時(shí)之內(nèi)完成對(duì)鼠傷寒沙門菌的高靈敏檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)將與鼠傷寒沙門菌高度特異的核酸適體通過雜交與固定在金電極表面的捕獲探針結(jié)合，當(dāng)有鼠傷寒沙門菌存在時(shí)，適體可與其特異性結(jié)合，這種結(jié)合力強(qiáng)于適體與捕獲

4、探針之間的雜交結(jié)合力，最終結(jié)果是核酸適體被菌體從捕獲探針上面置換下來，單鏈的捕獲探針重新暴露在金電極表面，此時(shí)加入事先準(zhǔn)備好的、檢測(cè)探針修飾的金納米粒子，在電化學(xué)反應(yīng)體系中即可產(chǎn)生電信號(hào)，此信號(hào)可被電化學(xué)工作站檢測(cè)并記錄下來，由于金納米粒子具有更大表面積位點(diǎn)可組裝更多的檢測(cè)探針，因此對(duì)產(chǎn)生的電信號(hào)具有顯著的放大作用。研究表明產(chǎn)生的電信號(hào)與鼠傷寒沙門菌濃度成正比。本方法在緩沖液中對(duì)鼠傷寒沙門菌檢測(cè)的線性范圍為2×101～2×106 CFU

5、 mL-1，在牛奶添加樣本中的線性范圍為2×102～2×106 CFU mL-1。本研究在臨床疾病的診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域具有很好的發(fā)展前景。
　　鹽酸米諾環(huán)素是第二代四環(huán)素類的廣譜抗生素，具有較強(qiáng)的抑菌作用。因其具有較好的脂溶性及組織穿透性，廣泛分布于其他抗生素難以到達(dá)的人體各組織。除了常規(guī)的抗菌抑菌作用外，近年來有研究發(fā)現(xiàn)其還具有抗炎、抗酶和神經(jīng)保護(hù)等作用。目前鹽酸米諾環(huán)素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、重氮偶合反應(yīng)法、

6、濁度法、電化學(xué)法、LC/UV、LC/MS等。但這些方法大多耗時(shí)、費(fèi)力操作復(fù)雜且靈敏度低。因此，建立一種用于鹽酸米諾環(huán)素高效、快速、簡(jiǎn)便、高靈敏的檢測(cè)新方法具有重要的臨床意義。流動(dòng)注射因其具有高效率、高精度、易操作等優(yōu)點(diǎn)，近年來已與化學(xué)發(fā)光法偶聯(lián)，在食品檢測(cè)、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)和生物分析等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。
　　在堿性條件下，K3［Fe(CN)6］氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，鹽酸米諾環(huán)素對(duì)該體系化學(xué)發(fā)光反應(yīng)具有顯著的抑制作用,據(jù)此我

7、們構(gòu)建了一種快速、靈敏測(cè)定鹽酸米諾環(huán)素的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光新方法。在所優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，化學(xué)發(fā)光抑制強(qiáng)度與鹽酸米諾環(huán)素的濃度在8.0×10-9～4.0×10-7g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9989.最低檢出限（LOD）為7.4×10-9g/mL，此遠(yuǎn)低于其他檢測(cè)方法的最低檢出限。對(duì)2.0×10-7g/mL的鹽酸米諾環(huán)素連續(xù)平行測(cè)定11次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%。此方法靈敏度高、重復(fù)性強(qiáng)、其實(shí)際樣本的檢測(cè)平均回收率在99.