Mesothelin抗體修飾的Fe3O4@SiO2納米探針在胰腺癌體內(nèi)外靶向成像中的實驗研究.pdf

1、胰腺癌(Pancreatic cancer，PC)早期癥狀不典型，侵襲性強，惡性程度高，對目前主要的治療手段不敏感，預后差，五年生存率接近5％。超過80％的患者在確診為胰腺癌時已處于疾病的晚期階段，失去手術切除的時機。分子影像學是近年來的研究熱點，分子影像學的技術和方法可用于胰腺癌的早期診斷及治療，有望早期精準發(fā)現(xiàn)胰腺癌，及時診斷、治療，改善預后。需要指出的是，目前的研究大多限于實驗室及動物實驗，研究中提出的一些胰腺癌新型靶向標志物仍處

2、于探索階段，尚未能應用于臨床。CA19-9是在臨床上唯一得到廣泛應用的胰腺癌標志物，但是其診斷胰腺癌的特異性及敏感性不高，僅具有一定的提示價值，或用于觀察胰腺癌患者對治療的反應等。間皮素(Mesothelin，MSLN)，是一種分子量為40kDa細胞表面糖蛋白，在胰腺惡性腫瘤組織內(nèi)高表達，在正常胰腺組織、急慢性胰腺炎癥及良性病變中不表達，是胰腺癌的新型標志物。超順磁性氧化鐵(SPIO)納米微粒作為MRI陰性對比劑，具有毒性小，生物相容性

3、高等優(yōu)點。本課題先在超順磁性氧化鐵SPIO(Fe3O4)微粒表面包裹一層無定形的SiO2組織，然后在其表面連接MSLN抗體，制備出新型的MRI陰性靶向磁性對比劑，分析該對比劑的表征、毒性作用，以及研究其與胰腺癌組織及細胞的體內(nèi)外靶向結(jié)合能力。
　　目的：
　　合成MSLN抗體修飾的Fe3O4@SiO2新型靶向性磁性納米探針(A-MFS)，作為MRI陰性對比劑。觀察納米探針的表征及毒性作用，并根據(jù)該納米探針對體外胰腺癌細胞及裸

4、鼠皮下胰腺癌移植瘤的靶向?qū)嶒?，分析其作為診斷胰腺癌的陰性MRI對比劑的可行性。
　　方法：
　　一、靶向性磁性納米探針(A-MFS)的制備
　　根據(jù)溶劑熱法合成Fe3O4納米顆粒，然后將氨基硅烷(SiO2-NH2)包裹在Fe3O4顆粒表面，制成Fe3O4@SiO2-NH2納米材料(FS)，最后在FS表面修飾連接MSLN抗體，合成靶向性磁性納米探針(A-MFS)，觀察該納米探針的形態(tài)特征、分散穩(wěn)定性、測量材料的流體動力直

5、徑及弛豫率。
　　二、靶向性磁性納米探針A-MFS的毒性實驗
　　將不同濃度的A-MFS納米探針分別與SW1990細胞共同孵育不同時間，采用CCK-8試劑盒測定細胞的活性率;對裸鼠的多個器官進行HE染色，觀察注射納米探針后器官的病理改變。
　　三、靶向性磁性納米探針A-MFS的體外靶向?qū)嶒?br>　　將水溶性紅色熒光量子點加到FS和A-MFS納米探針上，制備熒光納米探針，取處于對數(shù)期人胰腺癌細胞株SW1990分別與熒光

6、納米探針FS和A-MFS共同孵育30min，人肝癌細胞株LM-3作為對照，熒光顯微鏡下觀察熒光納米探針與細胞的吸附作用。胰酶消化SW1990及LM-3細胞后，分別與FS及A-MFS納米探針共同孵育1h，然后上樣進行流式細胞實驗，檢測納米探針與細胞的吸附率，從而定量觀察納米探針對胰腺癌細胞的體外靶向能力。
　　四、靶向性磁性納米探針A-MFS的體內(nèi)靶向?qū)嶒灒∕RI實驗）
　　取處于對數(shù)生長期SW1990細胞懸液(2×107/m

7、L)0.1mL注射在裸鼠右側(cè)腋窩皮下，注射成功后的裸鼠繼續(xù)放置于SPF級動物實驗室內(nèi)孵育，定期觀察腫瘤的生長情況。從建模成功的裸鼠中，選取精神狀態(tài)良好、移植瘤大小合適者，隨機分三組，麻醉后在西門子3.0T磁共振儀下進行成像，各組裸鼠經(jīng)尾靜脈分別注射生理鹽水、FS及A-MFS納米探針，對比注射不同溶液前后裸鼠移植瘤T2WI圖像，測量不同時間點移植瘤的T2WI信號強度。根據(jù)Fe在腫瘤及主要器官內(nèi)分布，定量分析納米探針對移植瘤的靶向作用。并且

8、進一步通過電鏡直接觀察腫瘤組織內(nèi)是否含有納米探針來驗證探針的靶向性。
　　結(jié)果：
　　一、靶向性磁性納米探針A-MFS的表征
　　A-MFS納米探針成功制備，該探針大小均勻一致，流體動力直徑集中在110-130nm，外觀呈球形。中心黑色的部分為電子密度較高的磁核，周圍灰色的部分為SiO2包裹層。XPS實驗結(jié)果表明Si和MSLN抗體成功連接到材料表面。A-MFS納米探針的分散穩(wěn)定性良好。A-MFS納米探針的橫向弛豫率(r

9、2)為59.435mM/s，縱向弛豫率（r1）為0.549 mM/s，r2/r1比值高，說明該納米探針可以作為MRI陰性對比劑，且陰性對比效果好。
　　一、靶向性磁性納米探針A-MFS的毒性
　　CCK-8實驗表明，不同濃度的A-MFS納米探針與SW1990孵育不同時間后，細胞活性始終高于85％。根據(jù)本次實驗結(jié)果，A-MFS在裸鼠體內(nèi)循環(huán)時間僅數(shù)小時，因此，A-MFS納米探針基本無毒性。而且注射A-MFS后裸鼠多個器官的HE

10、染色結(jié)果，與注射生理鹽水對比無差異。CCK-8實驗及HE染色結(jié)果均表明A-MFS納米探針的安全性高，可用于體內(nèi)外實驗研究。
　　三、靶向性磁性納米探針A-MFS的體外靶向?qū)嶒?br>　　A-MFS納米探針與SW1990共同孵育后，可在細胞表面觀察到較強的紅色熒光信號，信號強度高于FS與SW1990、A-MFS與LM-3共同孵育后的熒光信號。流式細胞實驗結(jié)果表明A-MFS與SW1990細胞的結(jié)合率最高。
　　四、靶向性磁性納米

11、探針A-MFS的體內(nèi)MRI靶向?qū)嶒?br>　　裸鼠體內(nèi)MRI圖像顯示，經(jīng)裸鼠尾靜脈注射A-MFS后，移植瘤的信號逐漸減低，約2.5h時降到最低。而注射FS和生理鹽水，移植瘤的信號無明顯減低。測量裸鼠移植瘤T2WI信號值顯示，注射A-MFS納米探針2.5h時裸鼠移植瘤的T2信號強度降低了約342.533±42.6，而注射生理鹽水及FS后移植瘤的T2信號強度分別降低了-61.233±33.9、-58.7±19.4，結(jié)果表明A-MFS組移植瘤

12、的信號明顯減低，與生理鹽水組及FS組差異顯著(P＜0.05)。裸鼠移植瘤及主要器官內(nèi)Fe分布結(jié)果顯示，注射A-MFS納米探針后腫瘤及肺組織（胸膜表達MSLN）內(nèi)Fe含量明顯高于注射FS材料組，其他器官（心、肝、脾、腎）Fe含量與注射FS材料組相仿。且A-MFS組的腫瘤組織在電鏡下可觀察到黑色的納米顆粒。
　　結(jié)論：
　　本研究將MSLN抗體連接到Fe3O4@SiO2納米材料表面，成功制備出靶向性磁性納米探針A-MFS。電鏡下