靶向uAR的胰腺癌雙模態(tài)分子探針構(gòu)建及體內(nèi)MR-光學(xué)成像研究.pdf

1、第一部分:胰腺癌靶向uPAR的雙模態(tài)分子探針的構(gòu)建
　　研究背景:根治性手術(shù)切除對(duì)于早期胰腺癌患者而言，是非常重要的預(yù)后因素。如果能在術(shù)中確定原發(fā)腫瘤的浸潤(rùn)邊界及局部侵犯的范圍，將會(huì)顯著降低腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，提高病人的生存期。基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒(upconversion nanoparticles，UCNP)的分子影像探針為胰腺癌邊界的檢測(cè)帶了巨大希望。這些上轉(zhuǎn)換納米材料與傳統(tǒng)的染料非常不同，它們能夠吸收和結(jié)合多個(gè)低能光子，通過(guò)反

2、斯托克過(guò)程釋放單一的高能光子即近紅外(near-infrared，NIR)發(fā)射光，有效地提高了光穿透組織的能力。并且，由于生物體內(nèi)沒(méi)有熒光體具有相似的性質(zhì)，自身熒光干擾可以在其成像中完全避免，從而增強(qiáng)了圖像的信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)。此外，上述納米顆?；|(zhì)中含有順磁性稀土元素釓(Gd)，顆粒本身具有本征的磁共振和上轉(zhuǎn)換特性，為雙模態(tài)分子探針的構(gòu)建提供了理想載體。酶的活性是腫瘤侵襲的關(guān)鍵因素，以酶直接作

3、為成像靶點(diǎn)將有助于我們明確腫瘤浸潤(rùn)的邊界。尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinaseplasmin-ogen activator receptor, uPAR)屬于絲氨酸蛋白酶，它與其配體尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen，uPA)結(jié)合后，調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，這些信號(hào)通路關(guān)系到細(xì)胞外基質(zhì)的降解，細(xì)胞的遷移，腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散以及腫瘤血管生成等方面，促進(jìn)了腫瘤的浸潤(rùn)。這種在胰腺癌邊界及腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)的

4、膜外受體，為腫瘤邊界成像提供了非常有價(jià)值的靶點(diǎn)。重組的氨基末端片段(amino termino fragment，ATF)是uPA與受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，它可以作為靶向探針與上轉(zhuǎn)換納米顆粒載體連接，構(gòu)建主動(dòng)靶向探針UCNP-ATF。該探針改變了傳統(tǒng)熒光造影劑單一的、下轉(zhuǎn)換發(fā)光的成像模式，增強(qiáng)了圖像的信噪比及光穿透深度，整合了目前先進(jìn)的納米技術(shù)、分子靶向和多模態(tài)成像，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌邊界的判定。
　　目的:制備以順磁性稀土納米顆粒為基質(zhì)

5、的高發(fā)光強(qiáng)度上轉(zhuǎn)換納米顆粒，并對(duì)其表面生物相容性及功能化修飾;探討制備方法和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾等因素對(duì)uPAR靶向的磁共振/上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒的晶體表征、光學(xué)性質(zhì)及弛豫時(shí)間的影響;合成重組的多肽ATF;研究UCNP-ATF的磁共振/上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒在體外對(duì)人胰腺癌細(xì)胞(SW1990)的靶向結(jié)合能力。
　　方法:通過(guò)高溫法合成了NaGdF4∶Yb，Er納米顆粒。為進(jìn)一步增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度，通過(guò)

6、種子生長(zhǎng)法，用NaGdF4∶Yb，Er制備了具有殼核結(jié)構(gòu)的新型納米顆粒NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4.通過(guò)透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)掃描，檢測(cè)NaGdF4∶Yb，Er及NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4納米顆粒的粒徑、形態(tài)等本征特性，并采用光譜掃描進(jìn)行光學(xué)性質(zhì)的研究。通過(guò)配體交換法將PEG的磷酸鹽和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)置換到核殼納米顆粒上，使其具有水溶性及生物相容性，

7、并利用發(fā)光光譜，表征修飾前后上轉(zhuǎn)換發(fā)光的穩(wěn)定性。同時(shí)，我們采用了臨床使用的3.0 T MRI(SiemensMAGNETOM Skyra)，對(duì)修飾后的納米顆粒的弛豫率進(jìn)行了表征。通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法，獲取uPAR1-135的氨基末端片段的cDNA。重組多肽ATF的特異性擴(kuò)增片段經(jīng)載體pET30α的轉(zhuǎn)化，在大腸桿菌DH5α株中表達(dá)，并用Ni2+-NTA柱進(jìn)行純化。將提純產(chǎn)物分別用Bradford法以及SDS-PAGE、Western-Bl

8、ot檢測(cè)，從而確定產(chǎn)物的純度和濃度。隨后，通過(guò)上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面上的馬來(lái)酰亞胺殘基與多肽ATF發(fā)生反應(yīng)，完成UCNP-ATF探針構(gòu)建。最后，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic light scattering，DLS)表征UCNP-ATF探針在PBS中的水合尺寸，并使用相同方法，偶聯(lián)相同分子量的不相關(guān)鼠蛋白，構(gòu)建非靶向性探針UCNP-mIgG作為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。在與靶向和非靶向探針共同孵育以后，人胰腺癌細(xì)胞系SW1990經(jīng)流式MarkⅡ

9、及MRI掃描后，分別在磁共振及近共聚焦顯微鏡下成像，檢測(cè)探針體外與細(xì)胞的結(jié)合能力。
　　結(jié)果:標(biāo)準(zhǔn)化Er3+粒子濃度以后，光譜結(jié)果顯示包殼后納米顆粒的整體發(fā)光強(qiáng)度是包殼前強(qiáng)度的70倍，表明核殼結(jié)構(gòu)顯著增強(qiáng)了納米顆粒的發(fā)光強(qiáng)度。并且，TEM圖像顯示，包殼后納米顆粒的尺寸、形態(tài)幾乎沒(méi)有發(fā)生改變，平均粒徑為18.6±0.9nm。PEG修飾后的水溶性非核殼結(jié)構(gòu)和核殼納米顆粒，在PBS中的光譜結(jié)果顯示，兩種顆粒的發(fā)光強(qiáng)度明顯下降，這可能是由

10、于水分子的高能振動(dòng)模式增加了激發(fā)態(tài)的非輻射弛豫所致。盡管包殼過(guò)程對(duì)PEG配體置換過(guò)程所造成的發(fā)光淬滅并沒(méi)有明顯改善，但是核殼納米顆粒仍較非核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒高57倍。細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)MRI成像結(jié)果顯示，包殼后的納米顆粒其摩爾弛豫率r1較包殼前稍有下降，考慮與納米粒徑稍有增加相對(duì)減小了顆粒比表面積，導(dǎo)致表面Gd3+離子比例相對(duì)減少有關(guān)。通過(guò)Ni柱提純的重組ATF，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford方法測(cè)定其濃度為0.4mg/ml，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)

11、染色的SDS-PAGE及Western-Blot分析其純度約90％。探針UCNP-ATF構(gòu)建前后的DLS結(jié)果顯示，探針構(gòu)建后水合尺寸明顯增大，說(shuō)明納米顆粒與多肽連接成功，并且DLS上沒(méi)有出現(xiàn)其它明顯的峰位，表明在連接過(guò)程中沒(méi)有形成沉淀或較大的聚集體。對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系SW1990孵育靶向探針的ImageStream流式MarkⅡ顯示圖像，UCNP-ATF探針能夠與細(xì)胞膜表面識(shí)別結(jié)合。MRI結(jié)果同樣證實(shí)，靶向探針比起非靶向探針對(duì)細(xì)胞有明顯的

12、T1信號(hào)增強(qiáng)作用及特異性。
　　結(jié)論:1.制備了強(qiáng)上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率的小粒徑(＜30nm)生物相容性納米顆粒。2.合成了多肽ATF，并與上述生物相容性納米顆粒連接，構(gòu)建了uPAR靶向的雙模態(tài)探針。3.細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)證明了該探針具備靶向人胰腺癌的主動(dòng)識(shí)別能力。
　　第二部分:胰腺癌靶向uPAR的雙模態(tài)分子探針體內(nèi)MR/光學(xué)成像研究
　　研究背景:對(duì)于探針的成像研究，除了敏感特異的成像手段，建立能更好表現(xiàn)出腫瘤血管生成，腫瘤病理

13、生理過(guò)程以及腫瘤微環(huán)境的動(dòng)物模型，同樣也是非常關(guān)鍵的。由于稀土納米顆粒有著先進(jìn)的生物相容性及多功能化修飾的特性，NaGdF4∶ Yb，Er納米顆粒通過(guò)主動(dòng)靶向的方式能夠成功實(shí)現(xiàn)皮下小于2mm的腫瘤探測(cè)。比起皮下腫瘤模型，動(dòng)物原位模型對(duì)于模擬人體腫瘤真實(shí)的微環(huán)境及較高的腫瘤轉(zhuǎn)移率都有著很高的優(yōu)越性。然而，由于建模過(guò)程復(fù)雜及目前納米材料糟糕的生物學(xué)表現(xiàn)，在動(dòng)物原位腫瘤模型中，開(kāi)展的分子探針體內(nèi)成像的研究并不多見(jiàn)。據(jù)最近的文獻(xiàn)稱，靶向uPAR

14、的多肽熒光探針被報(bào)道用于原位胰腺癌的成像研究中，然而，腫瘤信號(hào)卻受到周圍組織嚴(yán)重的自發(fā)熒光干擾，很難分辨。因此，無(wú)論是原位腫瘤模型的建立，還是開(kāi)發(fā)適合體內(nèi)成像的新型光學(xué)探針，目前都面臨著諸多挑戰(zhàn)。
　　目的:通過(guò)胰腺癌原位動(dòng)物模型開(kāi)展雙模態(tài)成像及病理學(xué)評(píng)估，探索uPAR靶向的磁共振/上轉(zhuǎn)換發(fā)光腫瘤納米探針在判定胰腺癌邊界的成像應(yīng)用，為下一步術(shù)中導(dǎo)航奠定基礎(chǔ)。
　　方法:通過(guò)外科手術(shù)建立裸鼠原位胰腺癌種植模型。為了在體監(jiān)測(cè)腫瘤

15、生長(zhǎng)情況，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)及螢火蟲(chóng)熒光素酶(Luciferase)基因的SW1990細(xì)胞系(GFP-Luc-SW1990)被用于監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展。我們將慢病毒載體（PRRL-EF1 a-GFPluc-WPRE）轉(zhuǎn)染到SW1990細(xì)胞中。通過(guò)細(xì)胞流式儀分析細(xì)胞GFPluc表達(dá)情況。之后，將40uL含有5×106個(gè)GFP-Luc-SW1990細(xì)胞的懸液注入裸鼠胰腺后，通過(guò)生物自發(fā)光活體成像儀(bioluminescence im

16、aging，BLI)驗(yàn)證腫瘤模型是否構(gòu)建成功。在原位模型構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)腫瘤感興趣區(qū)的信號(hào)測(cè)量，篩選發(fā)光強(qiáng)度相近的裸鼠模型作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。隨后，通過(guò)鼠尾靜脈注射3 mg/mL（15 mg Gd/Kg體重）靶向探針UCNP-ATF，分別于注射前、注射后第2、4、6小時(shí)行MRI成像及上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像。隨后，通過(guò)MRI T1 Mapping序列對(duì)腫瘤區(qū)域的T1絕對(duì)值進(jìn)行兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，測(cè)算出探針MRIT1時(shí)間縮短。同樣，在注射后第2

17、、4、6小時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型胰腺區(qū)域行上轉(zhuǎn)換成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，荷瘤小鼠斷頸處死，胰腺組織隨即石蠟切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ推溆嗾＝M織，經(jīng)電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀ICP檢測(cè)，觀察探針組織分布情況。
　　結(jié)果:細(xì)胞流式結(jié)果顯示GFP及Luciferace雙報(bào)告基因轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞的效率高達(dá)99.99％。原位種植裸鼠腫瘤模型建立10天后，BLI成像顯示建模成功率達(dá)90％。MRI成

18、像研究顯示，探針于腫瘤T1增強(qiáng)的峰值時(shí)間出現(xiàn)在注射后第4個(gè)小時(shí)，在第4個(gè)小時(shí)腫瘤區(qū)域T1信號(hào)下降達(dá)21％。上轉(zhuǎn)換成像結(jié)果表明，上轉(zhuǎn)換發(fā)光最大強(qiáng)度時(shí)間也出現(xiàn)在第4個(gè)小時(shí)，之后隨時(shí)間持續(xù)下降。探針組織分布情況顯示，大部分探針集中在正常肺臟部位，但攝取量非常低，還不及注射總量的10％，表現(xiàn)出很好的安全性。
　　結(jié)論:基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒的UCNP-ATF探針，在體內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)微小胰腺癌的檢測(cè)，在分子及組織水平上明確腫瘤的邊界，展現(xiàn)出了在