大鼠肢體缺血再灌注誘發(fā)急性肺損傷細(xì)胞自噬及烏司他丁防治的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肢體缺血再灌注(LIR)在臨床外科中較常見，如動(dòng)脈損傷或栓塞后再通、斷肢再植、肢體創(chuàng)傷及止血帶的長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用等。LIR不僅影響局部缺血組織的存活和功能，還可造成全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，并可能導(dǎo)致遠(yuǎn)隔多臟器功能衰竭(MODS)。其中，肺臟是回流靜脈血進(jìn)入的第一個(gè)臟器，靜脈血中的有害物質(zhì)最先作用于肺臟，肺臟是最易受損的器官之一，易造成急性肺損傷(ALI)。
　　自噬作為新的程序性細(xì)胞死亡的方式，在I/R中的作用越來越得到重視，自

2、噬體的形成是自噬發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。自噬體形成與自噬相關(guān)基因有關(guān)(autophagyassociated gene，ATG)，現(xiàn)在有很多方法可以檢測(cè)自噬的活性，其中免疫印跡(western blot)法檢測(cè)微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein lightchain3，LC3)的表達(dá)情況最為常用。
　　烏司他丁(ulinastatin，UTI)是從人尿中提取精制成的糖蛋白，是一種廣譜的酶抑制劑

3、，UTI降解形成的低分子產(chǎn)物仍對(duì)酶有高效抑制作用。
　　本研究旨在建立大鼠LIR致ALI模型，觀察LIR不同再灌注時(shí)間對(duì)自噬活性的影響，研究自噬在LIR致ALI中的作用，觀察UTI有效干預(yù)LIR細(xì)胞過度自噬提供依據(jù)，為減少LIR所致遠(yuǎn)隔組織器官損傷提供有效的治療靶點(diǎn)。.
　　第一部分 大鼠肢體缺血再灌注急性肺損傷細(xì)胞自噬及其相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　目的:
　　研究大鼠雙下肢缺血再灌注所致急性肺損傷(LIR-ALI)肺

4、組織細(xì)胞早期自噬及其相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　方法:
　　1.采用大鼠雙下肢缺血3h再灌注4h制備LIR-ALI模型。12只雄性SD大鼠，隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)（Sham）組，肢體缺血3h再灌注4h(I/R)組，每組6只。稱質(zhì)量后大鼠3％戊巴比妥鈉(首劑40mg/kg，維持劑量20mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上。Sham組僅雙側(cè)股三角處切開皮膚，分離出股動(dòng)脈，絲線標(biāo)記不結(jié)扎，縫合創(chuàng)口。I/R組分離出股動(dòng)脈后，于近腹

5、股溝韌帶處用無創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈使雙下肢缺血，縫合創(chuàng)口再以適度松緊的橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎雙下肢根部以防側(cè)枝循環(huán)，以捫不到足背動(dòng)脈搏動(dòng)、雙足變暗變涼為缺血成功的標(biāo)志;3h后打開原切口，去除動(dòng)脈夾恢復(fù)雙下肢血流再灌注4h，動(dòng)脈搏動(dòng)恢復(fù)及雙足逐漸變紅變暖為建立LIR模型成功。
　　2.再灌注4h末即刻剖開胸腔，直視下經(jīng)心尖部穿刺抽取3～4ml全血，采用ELISA檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，并放血處死

6、大鼠。
　　3.取雙肺組織，4℃的冰0.9％ NaCl溶液浸泡，肺變白后取下左肺放置于4％的多聚甲醛固定24 h以上，石蠟包埋后切片行免疫熒光染色測(cè)量，在倒置熒光顯微鏡下由?？漆t(yī)師閱片，觀察肺組織免疫熒光特異性標(biāo)記抗體的表達(dá)，并利用Image J2x軟件進(jìn)行免疫熒光強(qiáng)度分析。
　　4.利用RT-PCR法檢測(cè)各組肺組織Beclin1和Atg5 mRNA表達(dá):取右側(cè)肺組織100 mg，采用Trizol試劑盒抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反

7、應(yīng)合成cDNA，然后采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。
　　5.Western blot法檢測(cè)LC3蛋白表達(dá):取下剩余右側(cè)肺組織100 mg，-80℃保存，蛋白免疫印記(Western blot)測(cè)量肺組織LC3蛋白含量，將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析條帶凈光密度值，并計(jì)算LC3-Ⅱ/GAPDH的蛋白含量比值。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)測(cè):Sham組（2.35±0.03）×103U/L，I/R

8、組（6.66±0.08）×103U/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=119.242，P=0.000;P＜0.01）;I/R組血清LDH的活性顯著升高，提示大鼠LIR模型制備成功。間接表明本方法建立的LIR模型，能夠有效造成ALI。
　　2.免疫熒光染色鏡下Sham組可見正常肺組織且結(jié)構(gòu)清晰，而I/R組中肺組織結(jié)構(gòu)紊亂且肺泡壁增厚;免疫熒光強(qiáng)度值Sham組（5.54±0.23），I/R組（9.58±0.50），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義（t=17.979，P=0.000;P＜0.01）;I/R組的肺組織免疫熒光特異性標(biāo)記抗體高表達(dá)。
　　3.肺組織Beclin1和Atg5 mRNA相對(duì)定量表達(dá):I/R組與Sham組Beclin1和Atg5 mRNA2-△△CT比值分別為12.79、18.36，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。
　　4.Western blot法檢測(cè)LC3-Ⅰ蛋白含量?jī)艄饷芏戎礢ham組1699.65±50.85，I/R組6707.3

10、7±104.45，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=105.590，P=0.000;P＜0.01);LC3-Ⅱ蛋白含量?jī)艄饷芏戎礢ham組5783.73±130.55，I/R組12961.46±500.96，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.962，P=0.000;P＜0.01）;GAPDH蛋白含量?jī)艄饷芏戎礢ham組7631.27±111.61，I/R組7531.82±21.19，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.144，P=0.081

11、;P＜0.01）;LC3-Ⅱ/GAPDH比值，Sham組0.76±0.02，I/R組1.72±0.07，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.建立的LIR模型，能夠有效造成ALI，LIR-ALI建模成功。
　　2.大鼠雙下肢缺血3h再灌注4h引起了肺組織免疫熒光染色特異性標(biāo)記抗體的高表達(dá);
　　3.半定量RT-PCR法測(cè)定Beclin1和Atg5 mRNA相對(duì)表達(dá)量亦增高，促進(jìn)了自噬的激

12、活;而LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/GAPDH均顯著增高，LIR-ALI導(dǎo)致肺組織自噬上調(diào)。
　　總之，大鼠LIR-ALI后激活肺組織細(xì)胞自噬及其相關(guān)蛋白高表達(dá)。
　　第二部分 烏司他丁對(duì)大鼠肢體缺血再灌注急性肺損傷細(xì)胞自噬的影響
　　目的:
　　探討烏司他丁對(duì)大鼠雙下肢缺血再灌注導(dǎo)致急性肺損傷(LIR-ALI)肺組織細(xì)胞自噬的保護(hù)效應(yīng)。
　　方法:
　　采用前述方法制備肢體缺血3h再分別灌注0，2，4，8

13、h的LIR-ALI模型，72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)+生理鹽水(SO+NS)組，肢體缺血再灌注+生理鹽水（I/R+NS）組，肢體缺血再灌注+烏司他?。↖/R+UTI）組，每組再分4亞組，每亞組各6只。各時(shí)點(diǎn)末于大鼠左側(cè)頸內(nèi)靜脈分別注射NS或UTI5×104U/kg各1ml，按前述方法步驟，15min后采用ELISA法檢測(cè)血LDH和免疫熒光法檢測(cè)肺組織病理變化，利用RT-PCR法檢測(cè)各組肺組織Beclinl和Atg5mRNA表達(dá)及We

14、stern blot法檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.免疫熒光染色鏡下I/R+NS組0、2、4h時(shí)點(diǎn)可見肺組織結(jié)構(gòu)紊亂且肺泡間隔有增厚，8h時(shí)點(diǎn)肺泡腔明顯縮小甚至出現(xiàn)實(shí)變現(xiàn)象; SO+NS及I/R+UTI兩組中上述病理現(xiàn)象減輕。
　　2.采用2-△△CT法分析肺組織Beclin1和Atg5 mRNA相對(duì)表達(dá)量SO+NS組中不同時(shí)點(diǎn)均無明顯變化(P＞0.05);I/R+NS組中4，8h時(shí)點(diǎn)與0時(shí)點(diǎn)比較明顯增高

15、(P＜0.01或P＜0.05)，4時(shí)點(diǎn)最高(P＜0.01)，與SO+NS組中各相同時(shí)點(diǎn)比較均有明顯增高(P＜0.01)，亦以4h時(shí)點(diǎn)為甚(P＜0.01);I/R+UTI組中4h時(shí)點(diǎn)與0時(shí)點(diǎn)比較明顯增高(P＜0.01)，與SO+NS組中各相同時(shí)點(diǎn)比較均有明顯增高（P＜0.01或P＜0.05），與I/R+NS組比較4h時(shí)點(diǎn)降低最明顯(P＜0.01)。
　　3.Western blot法檢測(cè)LC3-Ⅱ蛋白含量及LC3-Ⅱ/GAPDH值S

16、O+NS組中2，4，8h時(shí)點(diǎn)與O時(shí)點(diǎn)比較均明顯增高（P＜0.01）;I/R+NS組中4，8h時(shí)點(diǎn)與O時(shí)點(diǎn)比較明顯增高(P＜0.01)，但LC3-Ⅱ/GAPDH值2時(shí)點(diǎn)有所下降(P＜0.01)，與SO+NS組中各相同時(shí)點(diǎn)比較均有明顯增高(P＜0.01);I/R+UTI組中4，8h時(shí)點(diǎn)與O時(shí)點(diǎn)比較均明顯增高(P＜0.01)，且與I/R+NS組比較各相同時(shí)點(diǎn)均有明顯降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.建立的LIR-ALI模

17、型可重復(fù)有效復(fù)制。
　　2.大鼠雙下肢缺血3h再分別灌注0，2，4，8h引起了肺組織免疫熒光染色特異性標(biāo)記抗體的高表達(dá);半定量RT-PCR法測(cè)定Beclin1和Atg5 mRNA相對(duì)表達(dá)量亦增高，肺組織細(xì)胞自噬上調(diào)，自噬的激活以4h時(shí)點(diǎn)為高峰期，8h時(shí)點(diǎn)稍下降;Western blot法檢測(cè)LC3-Ⅱ蛋白含量4，8h時(shí)點(diǎn)高表達(dá)，自噬泡的數(shù)量4h時(shí)點(diǎn)亦最多。
　　3.UTI靜脈注射使得Beclin1和Atg5 mRNA相對(duì)表達(dá)