大鼠移植肺缺血再灌注損傷中自噬的表達(dá)及作用初探.pdf

1、第一部分：自噬在大鼠移植肺缺血再灌注中的表達(dá)
　　目的：
　　建立大鼠左肺原位移植模型，觀察自噬在肺移植（Lung Transplantation，LT）缺血再灌注損傷（Ischemia Reperfusion Injury，IRI）中的表達(dá)，并觀察自噬表達(dá)水平隨再灌注時(shí)間的延長而發(fā)生的變化。
　　方法：
　　采用―改良三袖套吻合法‖建立大鼠原位左肺移植模型，將SD大鼠隨機(jī)分為5組（每組6只）：假手術(shù)組（S組）、

2、移植再灌注2h組（Y2組）、移植再灌注6h組（Y6組）、移植再灌注12h組（Y12組）、移植再灌注24h組（Y24組）。S組術(shù)后2h，其余各組于再灌注后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材，分別做以下檢測：①透射電鏡觀察自噬體在各組肺組織中的表達(dá)。②免疫熒光技術(shù)檢測自噬特異性標(biāo)記物 LC3B的表達(dá)；③用 RT-PCR檢測自噬相關(guān)基因 Beclin-1，Atg5的m RNA表達(dá)情況；④Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白 Beclin-1，LC3B的表達(dá)

3、情況。
　　結(jié)果：
　　1.形態(tài)學(xué)方面：①透射電鏡：與S組相比，Y2組電鏡下發(fā)現(xiàn)自噬體的存在；②免疫熒光檢測：與S組相比，各移植組LC3B陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多，以Y6組表達(dá)最多。
　　2.分子生物學(xué)方面：①RT-PCR檢測：與S組相比，各移植組Beclin-1,Atg5的mRNA表達(dá)量均不同程度的增加（P<0.05），Y6組表達(dá)量明顯高于其余各組（P<0.05）；②Western blot檢測：與S組相比，各移植組Be

4、clin-1，LC3B蛋白表達(dá)均不同程度的增加（P<0.05），Y6組表達(dá)量明顯高于其余各組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.肺移植再灌注后自噬表達(dá)被激活。
　　2.自噬在肺移植再灌注后2h即有表達(dá)，且隨時(shí)間延長，表達(dá)強(qiáng)度先升高再降低，并于再灌注后6h達(dá)到高峰。
　　第二部分：自噬在大鼠移植肺缺血再灌注早期中的作用初探
　　目的：
　　通過藥物抑制和激活自噬，觀察自噬對(duì)肺移植缺血再灌注損傷的影響

5、，初步探討其在肺移植LIRI中的潛在作用機(jī)制。
　　方法：
　　將SD大鼠隨機(jī)分為8組（每組6只）：假手術(shù)組（S組），假手術(shù)3-MA干預(yù)組（SM組），假手術(shù)BafilomycinA1干預(yù)組（SB組）,假手術(shù)Rapamycin干預(yù)組（SR組）,肺移植組（Y組），移植前3-MA干預(yù)組（M組），移植前BafilomycinA1干預(yù)組（B組）,移植前Rapamycin干預(yù)組（R組）。各假手術(shù)組關(guān)胸2h后取材檢測，各移植組再灌注2h后

6、取材檢測：①各組肺組織細(xì)胞自噬的表達(dá)情況。（檢測方法及指標(biāo)同第一部分）②酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法測定各組肺組織中 IL-1β,IL-10,TNF-α含量；③采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法測定各組肺組織中 MDA，MPO含量；④各組左肺靜脈血?dú)猓≒aO2、PaCO2、SaO2）、肺內(nèi)分流（Qs/Qt）等肺功能指標(biāo)；⑤各組左肺濕干比（W/D）；⑥各組肺組織石

7、蠟切片HE染色行病理學(xué)損傷程度評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　1.與S組相比，SM組、SB組、SR病理學(xué)未見明顯差異；肺功能指標(biāo)，肺濕干比,炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)，Beclin-1，Atg5的m RNA表達(dá)，Beclin-1，LC3B的蛋白表達(dá)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）.
　　2.與S組相比，移植各組病理學(xué)損傷加重，肺功能指標(biāo)，炎癥因子等指標(biāo)差異顯著（P<0.05），肺損傷加重，說明肺移植LIRI模型成功。LC3B熒光信

8、號(hào)表達(dá)增加，Beclin-1，Atg5的m RNA表達(dá)量增加（P<0.05），Beclin-1，LC3B的蛋白表達(dá)增加（P<0.05），說明移植各組發(fā)生自噬。
　　3.與 Y組相比，M組、B組 PaO2、SpO2降低，PaCO2、Qs/Qt增高，W/D比值升高（P<0.05），MDA、MPO、IL-1β、TNF-α含量均升高，IL-10含量降低（P<0.05）；R組PaO2、SpO2升高，PaCO2、Qs/Qt降低，W/D比值降低

9、（P<0.05），MDA、MPO、IL-1β、TNF-α含量均降低，IL-10含量升高（P<0.05）。
　　4.與Y組相比，M組和B組的LC3B熒光信號(hào)表達(dá)減弱，Beclin-1，Atg5的m RNA表達(dá)量減少（P<0.05），Beclin-1，LC3B的蛋白表達(dá)減少（P<0.05）；R組LC3B熒光信號(hào)表達(dá)增強(qiáng)，Beclin-1，Atg5的m RNA表達(dá)量增加（P<0.05），Beclin-1，LC3B的蛋白表達(dá)增加（P<0.

10、05）。
　　結(jié)論：
　　1.三種實(shí)驗(yàn)劑量的自噬干預(yù)劑不會(huì)引起假手術(shù)組的自噬強(qiáng)度變化，也不會(huì)直接造成肺損傷。
　　2.給予自噬抑制劑3-MA及BafilomycinA1后，肺移植再灌注早期細(xì)胞自噬表達(dá)被明顯抑制，同時(shí)LT后的LIRI進(jìn)一步加重。
　　3.給予自噬激活劑Rapamycin后，肺移植再灌注早期細(xì)胞自噬表達(dá)更加明顯，同時(shí)LT后的LIRI明顯減輕。
　　4.抑制自噬后，肺組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)增