FKBP52通過(guò)FOXA1調(diào)節(jié)雌激素受體ER和雄激素受體AR的平衡.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 FKBP52通過(guò)FOXA1調(diào)節(jié)雌激素受體ER和雄激素受體AR的平衡
　　目的：ER與AR同屬于甾體激素受體超家族的成員，其平衡對(duì)生物體正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程至關(guān)重要。健康女性中ER和AR的表達(dá)量相當(dāng)，而一些ER和AR失衡的組織內(nèi)疾病的發(fā)生率要顯著高于正常組織，說(shuō)明其平衡在人體穩(wěn)態(tài)中的重要性。FKBP52是一種共伴侶蛋白通過(guò)參與形成激素受體復(fù)合物發(fā)揮功能。FKBP52敲除雄性小鼠存在

2、乳腺發(fā)育的表型，前期研究發(fā)現(xiàn)FKBP52對(duì)ER/AR平衡產(chǎn)生影響，但具體的分子機(jī)制還缺乏了解。本課題通過(guò)對(duì)RNA-seq結(jié)果分析，結(jié)合免疫組化的結(jié)果，提出FKBP52可能通過(guò)FOXA1的影響ER與AR的平衡，并探究具體的分子機(jī)理。通過(guò)研究FKBP52基因敲除雄性小鼠乳腺發(fā)育的表型，對(duì)了解FOXA1在乳腺發(fā)育中及對(duì)ER和AR平衡的作用具有重要意義。
　　方法:1）表型分析及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。測(cè)量突變雄鼠、野生雌鼠和野生雄鼠的腳趾第二指及第

3、四指的長(zhǎng)度并計(jì)算比值，以及觀察突變雄鼠行為學(xué)方面的改變。2）RNA-seq測(cè)序。分離提取10天大小的突變雄鼠、野生雌鼠的乳頭和野生雄鼠相應(yīng)部位皮膚組織的RNA，測(cè)序篩選得到一些影響乳腺發(fā)育的基因;通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的分析找到可能影響乳腺發(fā)育的信號(hào)通路。3）Real-time PCR驗(yàn)證。將用作測(cè)序的同一批次的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)Real-time PCR以驗(yàn)證ER、AR以及一些變化較大的影響乳腺發(fā)育的基因的表達(dá)情況。4）免疫組化實(shí)驗(yàn)

4、。對(duì)相關(guān)基因在乳腺中的表達(dá)分布情況進(jìn)行檢測(cè)。5）體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。小鼠MEF細(xì)胞中檢測(cè)FKBP52、FOXA1、ERα的表達(dá)情況，人的乳腺癌細(xì)胞系中通過(guò)干擾和過(guò)表達(dá)FKBP52基因的表達(dá)檢測(cè)FOXA1的變化。6）放線菌酮(CHX)檢測(cè)蛋白穩(wěn)定性。7）Co-IP實(shí)驗(yàn)。探究FKBP52與FOXA1在蛋白水平的相互作用。
　　結(jié)果:1）突變雄鼠表型區(qū)別于野生雄鼠指長(zhǎng)比2D∶4D≥1，并且行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變雄鼠傾向于待在雄鼠用過(guò)的墊料內(nèi)，

5、這一選擇與野生雌鼠相似;綜上突變雄鼠表現(xiàn)出雌性化特征;2）RNA測(cè)序結(jié)果顯示突變雄鼠基因表達(dá)譜與野生雌鼠基本一致，F(xiàn)OXA1、CITED1、wnt5a、Col4a2、sox-15、sox-7、krt6-b、Ihh、btc、Igfbp2基因發(fā)生明顯變化;3）Real-time驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相同;4）免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在FKBP52敲除雄鼠乳腺中ERα表達(dá)上升，同時(shí)ERα的表達(dá)趨勢(shì)與FOXA1非常相近;5）FKBP52敲除的小鼠MEF

6、細(xì)胞FOXA1表達(dá)缺失，ERα表達(dá)上調(diào)，而在野生的MEF細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FKBP52發(fā)現(xiàn)FOXA1表達(dá)降低的現(xiàn)象，說(shuō)明FKBP52與FOXA1之間存在極強(qiáng)的調(diào)控關(guān)系，而雌激素處理實(shí)驗(yàn)也證明了FKBP52對(duì)FOXA1的調(diào)控依賴于ER。而在ER(+)的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和ER(-)的SK-BR-3中通過(guò)干擾和過(guò)表達(dá)FKBP52基因，發(fā)現(xiàn)在ER(+)的MCF-7細(xì)胞內(nèi)降低FKBP52的表達(dá)會(huì)造成FOXA1升高，過(guò)表達(dá)FKBP52后FOXA1

7、表達(dá)降低，而在ER(-)的SK-BR-3細(xì)胞則沒(méi)有觀察到這種變化，同樣說(shuō)明FKBP52和FOXA1在細(xì)胞內(nèi)存在直接調(diào)控關(guān)系，并且這種調(diào)控依賴雌激素受體ER;6）放線菌酮處理(CHX)實(shí)驗(yàn)揭示FKBP52降低后FOXA1蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng);7）Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示FKBP52和FOXA1在蛋白水平存在直接的相互作用。
　　結(jié)論:在FKBP52基因敲除雄鼠中，F(xiàn)KBP52的缺失造成了FOXA1蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)，進(jìn)而影響了FOXA1的表達(dá)導(dǎo)致下

8、游ER活性的增強(qiáng)并最終改變ER/AR間的平衡，這可能是產(chǎn)生雄鼠乳腺異常發(fā)育現(xiàn)象的原因。
　　第二部分 一種gRNA快速合成及檢測(cè)方法的建立
　　目的:建立一種gRNA快速合成及體外檢測(cè)的方法。
　　方法:設(shè)計(jì)引物并利用PCR技術(shù)迅速擴(kuò)增gRNA的DNA模板片段，然后通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄純化得到gRNA;最后通過(guò)體外反應(yīng)迅速對(duì)gRNA和Cas9酶切效率及特異性進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:體外合成的gRNA特異性強(qiáng)，活性高，在靶點(diǎn)