GEBP11多功能磁性納米探針對(duì)動(dòng)脈斑塊及腫瘤血管新生的多模態(tài)分子影像研究.pdf

1、背景：
　　惡性腫瘤和動(dòng)脈粥樣硬化是世界范圍內(nèi)危害人類健康的主要疾病，發(fā)病率均逐年上升，對(duì)其發(fā)病機(jī)制和疾病特征的研究有助于改進(jìn)診斷方法和提高療效。近年來(lái)，大量研究證實(shí)：血管新生廣泛參與腫瘤和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，且可能作為核心事件發(fā)揮關(guān)鍵作用。腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴性的需要血管生成，抗血管治療可使腫瘤體積顯著縮小，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。發(fā)生于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的血管新生可顯著增加斑塊的易損性，而抗血管治療能縮小斑塊面積，增加其穩(wěn)定性。常

2、規(guī)影像學(xué)技術(shù)不能滿足檢測(cè)腫瘤和動(dòng)脈斑塊中血管新生的臨床需求，嘗試新的成像靶點(diǎn)，改進(jìn)成像方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。分子影像學(xué)是一門(mén)新興的具有廣闊臨床應(yīng)用前景的學(xué)科，它可以結(jié)合多種成像模式在活體狀態(tài)對(duì)疾病進(jìn)程中的病理性分子進(jìn)行定性和定量研究。選擇特異的分子探針進(jìn)行各種模態(tài)的分子成像，有助于對(duì)疾病做出早期診斷。
　　GEBP11是本課題組利用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)，基于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothe

3、lial cell,HUVEC）與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)模型，經(jīng)多輪篩選獲得的環(huán)狀九肽。我們前期研究證實(shí)，GEBP11與正常HUVEC親合力不高，對(duì)經(jīng)過(guò)腫瘤細(xì)胞刺激，處于活化狀態(tài)的共培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Co-cultured human umbilical vein endothelial cell,Co-HUVEC）表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和力，具有特異性靶向新生血管的能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GEBP11在放射性核素131I標(biāo)記后，既可作為影像學(xué)探針對(duì)

4、活體胃癌血管進(jìn)行切倫科夫和單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(single photon emission computed tomography,SPECT)雙模態(tài)分子成像，又可作為放射性藥物發(fā)揮治療效用。盡管GEBP11具有易于合成修飾、組織穿透力強(qiáng)、免疫原性低、造價(jià)低廉等優(yōu)點(diǎn)，但與抗體等大分子蛋白相比，其在體內(nèi)血漿清除率高、半衰期短，需通過(guò)化學(xué)方法改善其藥代動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)以提升應(yīng)用價(jià)值。
　　磁性納米顆粒(magnetic nanopar

5、ticles,MNPs)以其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，可作為優(yōu)良的診斷治療工具應(yīng)用于生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。經(jīng)二巰基丁二酸(dimercaptosuccinic acid,DMSA)等生物相容性材料表面修飾后，將粒徑大小適宜的MNPs與肽、抗體等生物活性分子連接，可顯著延長(zhǎng)后者在血液循環(huán)中的停留時(shí)間，改善其生物學(xué)分布。與此同時(shí)，MNPs自身就是磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)的對(duì)比劑，又可作為載體連接熒光染料或

6、放射性核素，將多種成像模態(tài)融合。此外，MNPs還可用于攜帶化療藥物、放射性核素、微小核糖核酸(MicroRNA,miRNA)等發(fā)揮治療作用。
　　因此，我們?cè)O(shè)想構(gòu)建一種由GEBP11來(lái)特異性靶向新生血管，MNPs作為多功能載體，適用于MRI、熒光成像（fluorescence imaging,FI）和正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(positron emission tomography,PET)等多種影像學(xué)平臺(tái)的智能磁性納米探針成像系

7、統(tǒng)，并評(píng)估將其用于腫瘤和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊多模態(tài)分子成像的可行性。
　　研究目的：
　　1.構(gòu)建具有新生血管靶向能力，可用于熒光和MR雙模態(tài)分子成像的磁性納米顆粒Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs，對(duì)其進(jìn)行表征，體外研究其對(duì)Co-HUVEC的靶向能力和細(xì)胞毒性。
　　2.建立荷瘤裸鼠模型，通過(guò)熒光及磁共振成像技術(shù)在體評(píng)估Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs對(duì)腫瘤新生血管的fluorescence/MR雙

8、模態(tài)分子成像的應(yīng)用價(jià)值。
　　3.構(gòu)建具有新生血管靶向并具備PET或MR分子成像能力的磁性納米顆粒NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs，進(jìn)行探針的物理化學(xué)表征，體外研究確定其對(duì)Co-HUVEC的靶向能力和分析細(xì)胞毒性。創(chuàng)建68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs和GEBP11-DMSA-MNPs對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中新生血管的PET或MR分子成像方法，為易損斑塊的識(shí)別提供無(wú)創(chuàng)影像手段。
　　研究方法：

9、>　　1.在含有油酸的有機(jī)溶劑中熱分解乙酰丙酮鐵，獲得油性包覆的疏水MNPs，將其與DMSA進(jìn)行表面配體交換反應(yīng)，獲得水溶性單分散DMSA-MNPs。使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)、動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(vibrating sample magnetometer,VSM)對(duì)其進(jìn)行表征。
　　2.在1-(

10、3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)和氮-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide,NHS)催化下，通過(guò)縮合反應(yīng)將GEBP11和Cy5.5連接到DMSA-MNPs上，并使用TEM、DLS、VSM對(duì)Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs進(jìn)行表征。
　　3.在EDC和NHS催化下，通過(guò)縮合反應(yīng)將GEBP11和

11、螯合劑NOTA連接到DMSA-MNPs上，使用TEM和DLS對(duì)NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs進(jìn)行表征。
　　4.在體外對(duì)濃度梯度的Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs分別進(jìn)行fluorescence/MR成像，鑒定其光學(xué)和磁學(xué)特征。
　　5.將Co-HUVEC與Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs共孵育12小時(shí)，使用普魯士藍(lán)染色、激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning

12、 microscope，CLSM)檢測(cè)Co-HUVEC對(duì)MNPs的攝取。
　　6.將NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs與Co-HUVEC共培養(yǎng)24h，普魯士藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)其攝取，流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)檢測(cè)其凋亡和細(xì)胞周期。
　　7.制備裸鼠皮下胃腺癌荷瘤模型，尾靜脈注射Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs探針，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行熒光和 MR成像，分析其在體靶向腫瘤血管的能力，觀察其組織

13、器官分布情況。對(duì)腫瘤切片行普魯士藍(lán)和CD31免疫組化染色，以明確納米顆粒在腫瘤組織中的定位。
　　8.制作球囊損傷腹主動(dòng)脈合并高脂飲食喂養(yǎng)誘發(fā)新西蘭兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，通過(guò)超聲和血管內(nèi)超聲（intravenous ultrasound，IVUS）觀察斑塊形成，組織學(xué)染色鑒定斑塊成分。
　　9.將放射性核素68Ga螯合到NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs上，耳緣靜脈注射68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNP

14、s后PET成像。注射GEBP11-DMSA-MNPs并于注射前后4小時(shí)行MR成像。取標(biāo)本行普魯士藍(lán)染色，檢測(cè)斑塊組織中的納米顆粒。
　　結(jié)果：
　　1.成功合成了平均粒徑10nm左右，大小均一，平均水合粒徑63.2±4.1nm的DMSA-MNPs。其飽和磁化強(qiáng)度為62.7emu/g，可在水溶液中長(zhǎng)期保存，無(wú)聚集和沉淀。
　　2.連接GEBP11和Cy5.5后，Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs的平均水合尺寸增

15、加到82.8±6.5nm，飽和磁化強(qiáng)度減少為50.3emu/g，在水溶液中顆粒分散性穩(wěn)定。
　　3.TEM顯示，NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs的鐵核心平均粒徑大約12nm，粒徑分布較為均一，水合尺寸大約143nm，飽和磁化強(qiáng)度49.7emu/g，可在溶液中保持穩(wěn)定。
　　4.隨著Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs濃度增加，磁共振T2弛豫時(shí)間縮短，熒光信號(hào)增強(qiáng)，表現(xiàn)為磁共振T2加權(quán)圖像逐漸變暗，而熒光圖像

16、逐漸變亮，信號(hào)變化與探針濃度線性相關(guān)。激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)被細(xì)胞內(nèi)化的Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs主要位于胞漿。
　　5.將Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育12小時(shí)后，內(nèi)皮細(xì)胞的磁共振T2弛豫時(shí)間縮短，熒光信號(hào)增強(qiáng)普魯士藍(lán)染色顯示。與非GEBP11靶向組相比，Co-HUVECs對(duì)Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs攝取顯著增多。
　　6.與無(wú)關(guān)對(duì)照肽組相比，Co-HUVEC

17、對(duì)NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs攝取顯著增加。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，與正常細(xì)胞相比，攝取NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs后Co-HUVEC的凋亡和細(xì)胞周期無(wú)明顯變化。
　　7.活體熒光成像顯示，荷瘤裸鼠尾靜脈注射Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs，腫瘤組織在注射后24小時(shí)明顯顯像，其熒光信號(hào)在注射后36小時(shí)顯著強(qiáng)于其它器官，且洗脫相對(duì)緩慢。磁共振T2加權(quán)像成像結(jié)果顯示，與注射Cy5.5-GEBP11

18、-DMSA-MNPs前相比，腫瘤部位信噪比在注射后24小時(shí)和36小時(shí)分別平均降低約18.3％和23.7%。普魯士藍(lán)和CD31免疫組化染色證實(shí)，Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs特異性蓄積于腫瘤新生血管。
　　8.球囊損傷合并高脂飲食喂養(yǎng)12周成功誘導(dǎo)新西蘭兔腹主動(dòng)脈斑塊形成。
　　9.PET/CT成像結(jié)果顯示，68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs可被腹主動(dòng)脈斑塊攝取。磁共振成像顯示，GEBP11-D

19、MSA-MNPs注射后4小時(shí)斑塊組織T2加權(quán)像信噪比降低約19.3%。普魯士藍(lán)和CD31染色證實(shí)GEBP11-DMSA-MNPs特異性蓄積于斑塊新生血管。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)本課題的研究，我們成功制備了具有新生血管靶向性的多功能磁性納米顆粒，在體內(nèi)和體外證實(shí)GEBP11靶向的DMSA-MNPs可特異性的對(duì)共培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞有高親和力。Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs可用于Fluorescence/MR雙模態(tài)成像