羊膜載體對子宮內膜細胞HGF、MMP-9、VEGF表達的影響.pdf

1、近年來隨著人流、藥流手術及宮腔操作的增多，導致子宮內膜基底部全部或部分缺損、變薄，使子宮前后壁粘連、宮腔閉鎖,宮腔容積減小，引起患者月經(jīng)改變和生育異常。因此，宮腔粘連已成為婦科常見病之一，并且成為不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)的一項重要原因?，F(xiàn)階段宮腔粘連尤其是重度粘連患者治愈率低下，手術分離后粘連易復發(fā)，嚴重影響著廣大女性的身體及心理健康。因此宮腔粘連分離術后如何防止粘連復發(fā)、促進子宮內膜生長的治療是臨床工作的一大難題。目前，宮腔鏡下宮腔粘連切除術

2、（TCRA）是宮腔粘連治療的標準術式，術后放置宮內節(jié)育器、宮腔放置球囊、應用生物膠及防粘連膜并配合人工周期藥物治療等方法對預防其再粘連有一定的臨床療效。然而中、重度宮腔粘連患者，宮腔內創(chuàng)面較大，正常內膜組織較少，更易再度形成粘連，以上方法對此類患者療效欠佳。有學者利用羊膜移植治療重度宮腔粘連，發(fā)現(xiàn)其能夠促進子宮內膜再生從而降低宮腔再粘連的發(fā)生率。
　　羊膜具有抗原性低、促進上皮化、減輕炎癥反應、抑制纖維組織增生等作用，羊膜移植在眼

3、表重建及皮膚移植中均有所應用，并取得了令人滿意的效果。做為一種特殊的低免疫原性的物質，其擁有特殊的結構及分泌功能，新鮮羊膜中含大量生物活性物質，可以促進上皮細胞增殖分化，減少瘢痕形成及預防粘連等。目前羊膜已在各學科及手術領域廣為發(fā)展。近年來，羊膜的臨床應用范圍逐漸擴大，包括眼科、燒傷科、骨組織重建、泌尿系統(tǒng)等等，而在婦科，羊膜可以作為一種生物敷料應用于陰道重建、宮頸形成，也有實驗證實新鮮羊膜移植入IUA分離術后的宮腔，可以較好的降低宮腔

4、再粘連的發(fā)生率，有很好的應用前景。
　　目的：
　　本課題通過在新鮮羊膜基質面培養(yǎng)子宮內膜細胞，觀察細胞在羊膜基質面的生長情況，并采用Real time-PCR及ELISA兩種實驗方法比較以羊膜為載體培養(yǎng)的子宮內膜細胞與體外正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的子宮內膜細胞的肝細胞生長因子（HGF）、基質金屬蛋白酶（MMP-9）及血管內皮因子（VEGF）的表達水平，初步探索以人羊膜作為載體種植人子宮內膜細胞的可行性，為探索子宮內膜重建提供有效和來

5、源豐富的移植材料，并為探討羊膜移植預防宮腔粘連分子機制積累實驗數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1.采用膠原酶消化及篩網(wǎng)過濾等方法體外分離培養(yǎng)人子宮內膜基質細胞，通過形態(tài)學觀察及免疫組化法對培養(yǎng)的細胞進行鑒定；采用胰酶消化、機械刮除等方法制備去除羊膜上皮細胞的羊膜外基質支架。
　　2.將體外擴增傳代的子宮內膜細胞種植在去除羊膜上皮細胞的羊膜外基質支架上作為實驗組，以無羊膜載體培養(yǎng)的子宮內膜細胞為空白對照組。倒置顯微鏡下觀察兩組細

6、胞生長形態(tài)的變化，實時熒光定量PCR法測定各組細胞HGF、MMP-9、VEGF mRNA的表達水平，ELISA法測定各組細胞MMP-9蛋白表達量的變化。
　　3.將實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，不同組間mRNA及蛋白相對表達量符合正態(tài)分布的定量資料，兩兩比較采用采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。
　　結果：
　　1.子宮內膜細胞形態(tài)學特點及免疫組化結果：培養(yǎng)出的子宮內膜細胞多為多角形，細胞兩端

7、有多個短小突起，細胞排列無極性，貼壁生長。隨著細胞的傳代培養(yǎng)，細胞逐漸拉長成梭形，具有成纖維細胞形態(tài)。細胞生長周期一般為7-10天，第1天為潛伏生長期，第2-4天進入對數(shù)生長期，5-6天后達平臺期，7天后逐漸萎縮消退。子宮內膜基質細胞特異的波形蛋白抗體(Vimentin)染色呈陽性，陽性細胞的胞質呈棕黃色，角蛋白(CK19)抗體染色陰性。
　　2.將第二代子宮內膜細胞接種于羊膜載體2h后，細胞粘附羊膜基質，呈小圓球狀、散在分布、折

8、光性較好，但尚未貼壁。12h后，細胞少量貼壁，逐漸聚集成團、成片生長，與培養(yǎng)皿上生長增殖的子宮內膜細胞形態(tài)相似，但細胞排列欠規(guī)則，細胞與細胞之間連接緊密，并有細胞拉長，相互交通呈網(wǎng)狀。l周左右可觀察到明顯成片生長的細胞。羊膜載體在培養(yǎng)的第10天左右開始出現(xiàn)皺縮，細胞出現(xiàn)凋亡。
　　3.在羊膜基質面培養(yǎng)的子宮內膜細胞，HGF mRNA含量為2.033±0.922， MMP-9 mRNA含量為1.356±0.399，VEGF mRNA

9、含量為0.976±0.597；對照組mRNA HGF含量為1.299±1.004，MMP-9含量為0.871±0.529，VEGF含量為0.426±0.193；三組因子mRNA表達實驗組均較對照組高,差異有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　4.ELISA檢測細胞裂解液MMP-9蛋白表達量，羊膜載體組為（0.762±0.085） ng/ml，對照組為(0.089±0.008)ng/ml，羊膜載體組較對照組MMP-9蛋白表達量高，