聚羧基甜菜堿修飾的脂質(zhì)體對腫瘤治療的應(yīng)用研究.pdf

1、目前，長循環(huán)脂質(zhì)體主要采用親水性的聚乙二醇（PEG）及其衍生物進(jìn)行改性。然而，研究表明PEG的修飾降低了脂質(zhì)體與細(xì)胞間的作用。更重要的是，在動物體內(nèi)重復(fù)注射，會出現(xiàn)第一次給藥的 DSPE-PEG脂質(zhì)體導(dǎo)致后續(xù)注射脂質(zhì)體從血液中迅速清除，在肝臟部位大量聚集的現(xiàn)象，即加速血液清除（accelerated blood clearance, ABC）現(xiàn)象。這一現(xiàn)象導(dǎo)致藥物在靶部位的富集下降，治療效果差，甚至引起臨床的毒副作用。
　　針對

2、PEG修飾在應(yīng)用時存在的缺點，本實驗室自行合成有具有 pH敏感性的基于兩性離子聚合物聚羧基甜菜堿（PCB）的脂質(zhì)分子DSPE-PCB20，其可以在pH為7.4的生理條件下，利用PCB分子中正負(fù)電荷與水分子間的靜電相互作用抵抗非特異性蛋白吸附。鑒于PCB分子中含有正電荷基團(tuán)，其可以有效促進(jìn)脂質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)吞作用，加快脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞的能力。同時，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)涵體（pH=4.5-6.0）的酸性條件下，PCB分子中的羧酸根可以發(fā)生質(zhì)子化，增加脂質(zhì)

3、體表明正電荷，提高脂質(zhì)體的內(nèi)涵體逃逸能力，使化療藥物分子高效進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮腫瘤抑制效果，對于替代 DSPE-PEG作為長循環(huán)修飾分子對脂質(zhì)體進(jìn)行修飾具有非常大的潛力。為此，課題利用PCB分子抗非特異性蛋白吸附及pH敏感的性能，與脂質(zhì)體相結(jié)合，制備血液循環(huán)時間長、細(xì)胞內(nèi)吞效果好及內(nèi)涵體逃逸能力強的長循環(huán)脂質(zhì)體。同時研究 DSPE-PCB脂質(zhì)體的體內(nèi)藥代動力學(xué)和分布性質(zhì)，考察其是否可以避免ABC現(xiàn)象，提高藥物在腫瘤部位的富集及抗腫瘤活性，其

4、主要內(nèi)容如下：
　　1、DSPE-PCB修飾的脂質(zhì)體分別包載鹽酸阿霉素（DOX）和拓?fù)涮婵蝶}酸鹽（TPT）及其物理化學(xué)表征。采用硫酸銨梯度法分別制備包載TPT和DOX的脂質(zhì)體，對其粒徑、電位、血清穩(wěn)定性和載藥率等物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了評價，最終制備得到粒徑約100 nm、電位約為1.2 mV、包封率約為90-95％的脂質(zhì)體制劑，同時具有優(yōu)秀的血清穩(wěn)定性。采用冷凍透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）對脂質(zhì)體的形貌進(jìn)行表征，并測定脂質(zhì)體在不

5、同pH條件下的體外藥物釋放曲線，以及用動態(tài)光散射粒度儀和冷凍透射電子顯微鏡檢測在不同pH條件下脂質(zhì)體粒徑的變化。通過以上實驗，課題所制備的載藥脂質(zhì)體滿足納米制劑的粒徑要求，具有優(yōu)秀的血清穩(wěn)定性，同時也滿足體內(nèi)應(yīng)用的要求，并且 DSPE-PCB修飾的載藥脂質(zhì)體和pH響應(yīng)藥物可控釋放能力。
　　2、考察載藥脂質(zhì)體對A549人肺腺癌細(xì)胞的體外抗腫瘤活性。使用MTT法考察空白脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞的毒性作用及DOX和TPT脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞存活率

6、的影響；使用激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀和活細(xì)胞工作站考察腫瘤細(xì)胞對載體的內(nèi)吞情況及其內(nèi)吞機制；通過Annexin V-FITC分析腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明，與 DSPE-PEG載藥脂質(zhì)體相比，DSPE-PCB載藥脂質(zhì)體具有顯著的細(xì)胞毒性，并且通過改變細(xì)胞的內(nèi)吞方式更有效地內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
　　3、脂質(zhì)體的藥代動力學(xué)研究。以雄性 SD大鼠為研究對象，給藥間隔時間為5天重復(fù)注射3次脂質(zhì)體制劑，考察藥物在大鼠

7、體內(nèi)血液清除，并且檢測給藥5天后血漿內(nèi)免疫球蛋白IgM含量。結(jié)果表明，DSPE-PEG TPT脂質(zhì)體在后續(xù)給藥時半衰期明顯的減小，并且血漿內(nèi)IgM蛋白的含量明顯升高，存在ABC現(xiàn)象，而DSPE-PCB組的半衰期、血漿中IgM沒有發(fā)生變化，證明了DSPE-PCB可以起到長循環(huán)的作用而并不引起ABC現(xiàn)象。
　　4、脂質(zhì)體的體內(nèi)分布及抗腫瘤作用研究。以 A549荷瘤裸鼠為動物模型，對脂質(zhì)體的體內(nèi)分布及抗腫瘤作用進(jìn)行研究。對荷瘤裸鼠間隔5

8、天兩次給藥，發(fā)現(xiàn)DSPE-PEG脂質(zhì)體第二次給藥在肝臟的清除明顯升高，而 DSPE-PCB脂質(zhì)體在肝臟的清除沒有發(fā)生變化，并且在腫瘤部位的富集遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于DSPE-PEG脂質(zhì)體。此外，采用激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤冰凍切片來考察藥物在腫瘤內(nèi)的分布，結(jié)果表明 DSPE-PCB脂質(zhì)體能更加高效地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。抑瘤實驗結(jié)果表明DSPE-PCB脂質(zhì)體組具有較高的抑瘤效果（DSPE-PCB/DOX抑制率為80.8%， DSPE-PCB/TPT為71.9

9、%），遠(yuǎn)大于對照組DSPE-PEG脂質(zhì)體組（DSPE-PEG/DOX抑制率為36.6%，DSPE-PEG/TPT為29.2%）。通過對裸鼠腫瘤的TUNEL染色切片分析，證明了DSPE-PCB脂質(zhì)體和DSPE-PEG脂質(zhì)體相比，能夠明顯地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了由兩性離子DSPE-PCB20修飾的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體不僅具有顯著地抗非特異性蛋白吸附性能，有效延長了脂質(zhì)體的血液循環(huán)時間。同時DSPE-PCB也克服