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文檔簡介
1、目的:
腫瘤靶向制劑已成為近幾年治療癌癥的研究熱點(diǎn),此種制劑可以將藥物盡可能多的輸送到靶組織,進(jìn)而發(fā)揮藥物的治療作用。脂質(zhì)體具有類似生物膜的結(jié)構(gòu),作為納米給藥制劑的一種非病毒載體,因其具有低的免疫原性、低毒性以及靶向性等優(yōu)點(diǎn),已廣泛作為腫瘤靶向制劑的重要載體。但是,脂質(zhì)體仍然存在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除、穩(wěn)定性差、攝取效率低等問題,因此,設(shè)計(jì)一種修飾后的改良脂質(zhì)體對(duì)生物大分子有效輸送到靶器官具有重要意義。
本研究構(gòu)建
2、了三種具有不同功能性脂材的PEG化脂質(zhì)體:普通載藥脂質(zhì)體NL、CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵CPP修飾載藥脂質(zhì)體CHL。并對(duì)三種脂質(zhì)體進(jìn)行電位和粒徑的表征,以MCF-7和A549細(xì)胞為模型細(xì)胞,對(duì)不同脂質(zhì)體與細(xì)胞作用特點(diǎn)進(jìn)行考察。
方法:
1、琥珀酰亞胺基-對(duì)甲?;郊姿峒柞?SFB)和3-馬來酰亞胺基丙酸酰肼(MPH)分別制備儲(chǔ)備液,充氮?dú)?,室溫?cái)嚢?,旋蒸揮去有機(jī)溶劑,得干燥的黃色固體S-M。
2、自制
3、的S-M與DSPE-PEG-NH2分別溶解,室溫充氮?dú)鈹嚢?,得中間體DSPE-PEG-Hz。
3、取CPP樣品管,室溫平衡30min溶解,加入到DSPE-PEG-Hz溶液中,充氮?dú)?,室溫避光反?yīng)48h,旋蒸揮干有機(jī)溶劑,得黃色目標(biāo)產(chǎn)物DSPE-PEG-Hz-CPP。
4、構(gòu)建普通載藥脂質(zhì)體NL、CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵CPP修飾載藥脂質(zhì)體CHL,并用馬爾文粒度儀進(jìn)行粒徑和電位的表征。
操作方法如下:
4、
分別以SPC/DC-chol/Chol/DSPE-PEG、SPC/DC-chol/Chol/DSPE-PEG/DSPE-PEG-CPP、SPC/DC-chol/Chol/DSPE-PEG/DSPE-PEG-Hz-CPP為脂材旋轉(zhuǎn)成膜,加DEPC水(含siRNA3.75nmol),手搖水化脫膜,水浴超聲,得半透明體系NL、CL、CHL。
5、用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡分析經(jīng)NL、CL、CHL處理的MCF-7和A5
5、49細(xì)胞,流式分析以胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度考察指標(biāo),評(píng)價(jià)細(xì)胞攝取效率。激光共聚焦顯微鏡清楚地顯示了三種制劑輸送siRNA至細(xì)胞中的位置。
6、用激光共聚焦顯微鏡分析經(jīng)CL、CHL處理的A549細(xì)胞,觀察siRNA是否從內(nèi)涵體中逃逸,發(fā)揮基因沉默效應(yīng)。
結(jié)果:
1、合成S-M:黃色固體粉末,質(zhì)譜圖中m/z=413.36,與S-M理論計(jì)算值413.36(M+H+)相符,證明產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確。
2、合成DSPE-
6、PEG-Hz:中間體平均離子峰為3103.41,與理論設(shè)計(jì)肽平均分子量相符,證明產(chǎn)物中有目標(biāo)中間體。
3、合成DSPE-PEG-Hz-CPP:產(chǎn)物平均分子離子峰為4611.08,與理論設(shè)計(jì)肽平均分子量相符,證明合成了目標(biāo)產(chǎn)物。但是質(zhì)譜圖中可看到一個(gè)平均分子量為2832.19的雜峰,為第二步的原料DSPE-PEG-NH2,產(chǎn)物合成的方法以及純化的步驟還需改進(jìn)。
4、載藥普通脂質(zhì)體NL、CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵C
7、PP修飾載藥脂質(zhì)體CHL粒徑和電位測得結(jié)果如下:
NL、CL、CHL的平均粒徑分別為124.9nm、145.6nm、156.1nm,分散指數(shù)(PDI)平均值分別為0.302、0.246、0.284,制得的脂質(zhì)體粒徑均符合要求,且粒徑分布集中,體系均趨于穩(wěn)定。
5、用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦分析經(jīng)三組制劑處理的細(xì)胞
相比陰性對(duì)照組,普通載藥制劑NL處理的細(xì)胞胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度有很大的提高,表明DSPE-PEG修飾
8、的PEG化脂質(zhì)體提高了細(xì)胞攝取效率。
CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵CPP修飾載藥脂質(zhì)體CHL處理的細(xì)胞胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度相比NL大幅提高,表明CPP修飾的載藥PEG化脂質(zhì)體能進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的攝取效率。
激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示,三種制劑均成功地將siRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中,經(jīng)CPP修飾的脂質(zhì)體CL、CHL輸送siRNA至細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)目(綠色熒光)相比普通脂質(zhì)體NL明顯增多,與流式分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)。
6、用激光
9、共聚焦顯微鏡分析經(jīng)CL、CHL制劑處理的A549細(xì)胞
兩組制劑均成功將siRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中,且隨著制劑作用時(shí)間的延長,細(xì)胞質(zhì)中siRNA的數(shù)目越多,表明經(jīng)CPP修飾的脂質(zhì)體有效地促進(jìn)了siRNA的胞內(nèi)逃逸。
結(jié)論:
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DSPE-PEG-Hz-CPP的合成路線簡單,合成過程中未用高毒性試劑,方法重現(xiàn)性好。
成功地制備了含腙鍵的CPP修飾的載藥脂質(zhì)體CHL,并與普通脂質(zhì)體NL和CPP修
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