MircoRNA-27a靶向調控BMSCs分化預防激素性股骨頭壞死的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　激素性股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head, ONFH）有極高的致殘率，其預防和治療已經成為世界性的難題。激素性 ONFH發(fā)生可能是由于激素的作用改變了細胞中的一些miRNA表達，影響了相應靶向基因調控作用，從而使正常骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenhymal stem cells,BMSCs)的分化受到影響，造成了大量脂肪細胞的生成，和成骨細胞形成的

2、大量減少，影響了正常骨細胞的修復。因此促進成骨細胞的分化和減少成脂細胞的分化是我們預防和治療激素性 ONFH最要的環(huán)節(jié)。以往的研究通過單一基因的改變來預防骨壞死，而本研究主要是利用miRNA具有多個靶向位點，篩選出具有抑制成脂肪分化同時具有促進成骨分化的MicroRNA-27a基因，采用目前較成熟的RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術，通過將雙向調控基因 MicroRNA-27a電轉入大鼠BMSCs中，運用細胞學

3、、生物化學和分子生物學等多種的檢測手段和方法檢測該基因對于成骨和成脂的影響。在國內外的報道中，尚未有miRNA雙靶向基因調控預防激素性ONFH。
　　材料與方法：
　　選用2~3月齡的SD大鼠，體重約為180~200g，處死后取骨髓細胞，培養(yǎng)并制備大鼠BMSCs。將實驗分為4組，MicroRNA-27a組（miRNA1，M）：將具有雙向靶向作用的MicroRNA-27a電轉入大鼠BMSCs中并且加入激素誘導；陰性對照組（Ne

4、gativeControl，NC）：將無效序列的基因電轉入大鼠BMSCs中并在培養(yǎng)基中加入激素誘導；激素模型組（Model，M）：將 BMSCs單純的給予激素誘導；正常對照組（Normal，N）：無需特殊因素處理；對于激素誘導的各組細胞中保持地塞米松濃度為10-7mol/L，按時更換細胞液并定期觀察細胞的形態(tài)及。
　　在激素誘導第3天和第7天時，采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)技術分別測定各實驗組中的PPARγmR

5、NA、BMP mRNA的相對表達量。在激素誘導14天時，采取ELISA試劑盒測定各實驗組中的骨鈣素分泌量和甘油三脂的含量。在誘導14天時，對各組細胞進行免疫組化，記錄并分析各組PPARγ、BMP蛋白表達水平。誘導21天時用油紅O方法對各組細胞進行細胞染色，用倒置顯微鏡觀察并記錄脂肪細胞的數量。
　　結果：
　　1、各實驗組PPARγ mRNA和BMP mRNA表達檢測結果:
　　實驗第3天和第7天，測得陰性對照組和激素

6、模型組中的PPARγmRNA呈高表達，與正常對照組相比較，差異值有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。MicroRNA-27a組中的PPARγ mRNA呈低表達，與正常對照組無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。陰性對照組和激素模型組中的BMP mRNA呈低表達，與正常對照組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。MicroRNA-27a組中的BMP mRNA呈高表達，表達水平與正常對照組無統(tǒng)計學差異。（P>0.05）。
　　2、各實驗組BMSCs脂

7、肪染色和脂肪細胞計數結果：
　　實驗第21天，進行油紅O染色并計數，與正常對照組相比較，激素模型組以及陰性對照組中脂滴數量升高增多，兩者的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。MicroRNA-27a組中脂滴量稍稍多于正常對照組，所檢測的差異值均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；且脂滴量明顯低于陰性對照組和激素模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3、各實驗組骨鈣素含量和甘油三酯含量檢測結果：
　　實驗第14天，與

8、激素模型組和陰性對照組與與正常對照組相比較，骨鈣素含量降低，甘油三脂含量升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。MicroRNA-27a組檢測的骨鈣素含量稍低于正常對照組，甘油三脂含量稍高于正常對照組，差異值均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　4、各實驗組免疫組化測定PPARγ以及BMP-2蛋白表達MIOD結果：
　　實驗14天，通過免疫組化測得陰性對照組和激素模型組中的PPARγ表達量高，與正常對照組差異均有統(tǒng)計學意義

9、（P<0.05）。MicroRNA-27a組中的PPARγ表達量低，與正常對照組間的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。陰性對照組和激素模型組中的 BMP表達低，與正常對照組差異均有統(tǒng)計學意義（ P<0.05）。MicroRNA-27a中的 BMP表達量高，表達水平與正常對照組無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　結論：
　　1.MicroRNA-27a能抑制成脂基因的表達，促進成骨基因的表達。
　　2.依據MicroRN