基于色譜分離和13C NMR模式識(shí)別聯(lián)用技術(shù)在八角蓮活性成分分離鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、天然產(chǎn)物是新藥研發(fā)的一個(gè)重要源泉。我國(guó)是中藥資源豐富的國(guó)家，但這些寶貴的中藥資源其成分十分復(fù)雜，如何快速有效地識(shí)別和分離純化這些資源中的活性成分是當(dāng)前天然產(chǎn)物研究中的重要問(wèn)題。因此，本論文選取了我國(guó)傳統(tǒng)中藥八角蓮作為研究對(duì)象，建立了幾種有效分離和識(shí)別其活性成分的方法，為開(kāi)發(fā)中藥資源奠定了一定的科學(xué)基礎(chǔ)。
　　論文首先建立了一種基于反相液相色譜分離-13C NMR模式識(shí)別的研究策略，能夠從八角蓮代謝產(chǎn)物中快速識(shí)別已知的成分，進(jìn)行去重

2、復(fù)化操作;同時(shí)能夠迅速地尋找出可能未知的成分進(jìn)行靶向地分離純化。整個(gè)過(guò)程只需要簡(jiǎn)單的液相分離(reversed-phase liqiudchromatography, RPLC)和進(jìn)一步的NMR圖譜分析便能完成。最終利用13C NMR在線數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)檢索從聚類的13C NMR二維圖譜數(shù)據(jù)中快速地識(shí)別出7種已知的化合物，包括5種鬼臼毒素類化合物和2種黃酮類化合物。另外根據(jù)HPLC及13C NMR二維圖譜數(shù)據(jù)信息，鑒別出6種新的雙黃酮類

3、成分和另外2種己知成分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定分析。這是首次基于RPLC分段方法和離線的13C NMR為基礎(chǔ)的模式識(shí)別方法對(duì)天然代謝產(chǎn)物中己知和未知成分進(jìn)行快速鑒定識(shí)別和靶向分離純化的實(shí)例，它包含了非靶向的不完全分離和靶向的定向分離兩個(gè)過(guò)程。這種方法的建立對(duì)于天然代謝產(chǎn)物的去重復(fù)化和新成分的快速定位等都具有重要的意義。
　　其次為了有效地分離制備天然產(chǎn)物中的活性成分，采用了系統(tǒng)的液-液萃取-13C NMR模式識(shí)別，并結(jié)合新型錐度逆流

4、色譜分離的方法，對(duì)八角蓮中的活性成分進(jìn)行了有效的制備分離。首先利用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(hexane-ethyl acetate-methanol-water, HEMWat)四元溶劑體系系統(tǒng)地對(duì)八角蓮根莖中的成分進(jìn)行選擇性的萃取分離，并利用13C NMR技術(shù)對(duì)得到的萃取產(chǎn)物中的化學(xué)成分進(jìn)行表征，最后針對(duì)不同的成分利用新型的錐度逆流色譜進(jìn)行有效的制備分離。首先利用HEMWat(1∶9∶1∶9，v/v/v/v)體系對(duì)富含糖類和糖苷類

5、成分的HEMWat(2∶8∶2∶8，v/v/v/v)下相萃取產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化，得到了5種鬼臼毒素類和黃酮類化合物的糖苷。其次在對(duì)HEMWat(2∶8∶2∶8，v/v/v/v)上相萃取產(chǎn)物進(jìn)行脫脂之后，利用HEMWat(4∶6∶4∶6，v/v/v/v)體系分離得了12種鬼臼毒素類及黃酮類化合物，質(zhì)量占70％以上的成分是鬼臼毒素類化合物，約占30％的成分是黃酮類化合物，其中包含2個(gè)已知的和1個(gè)新的雙黃酮類化合物。結(jié)果表明基于液-液分離-1

6、3C NMR模式識(shí)別并結(jié)合錐度逆流色譜分離的研究策略能夠有效地對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行有效的萃取和分離制備。
　　最后利用抗腫瘤活性跟蹤的方法，以人類肝癌細(xì)胞HepG2為篩選模型，利用逆流色譜技術(shù)，通過(guò)梯度洗脫的方式從八角蓮提取物中快速分離得到了四種活性最強(qiáng)的鬼臼毒素類化合物，分別是4'-去甲基鬼臼毒素，鬼臼毒素，α-足葉草素以及β-足葉草素。在實(shí)驗(yàn)中，只需要一步的CCC分離便能得到3個(gè)純度都在95％的鬼臼毒素類化合物，另外一個(gè)化合物的純度