腦缺血預(yù)處理對缺血再-灌注損傷大鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞及血管新生的影響.pdf

1、目的：
　　缺血性卒中是最常見的腦血管病，近年來缺血性卒中發(fā)病率成上升趨勢，是人類致死致殘的主要原因之一，深入研究缺血性卒中后機(jī)體病理生理變化對疾病的預(yù)防和治療尤為重要。
　　本實(shí)驗(yàn)中:
　　1、研究大鼠腦缺血/再灌注損傷后不同時期外周血EPCs的數(shù)量變化規(guī)律及血管新生情況。
　　2、研究腦缺血預(yù)處理對大鼠腦缺血/再灌注損傷后不同時期外周血EPCs的數(shù)量變化規(guī)律及血管新生情況的影響。
　　3、分析外周血EP

2、Cs的數(shù)量變化規(guī)律與缺血區(qū)血管新生情況的關(guān)系。
　　材料和方法：
　　1、材料
　　(1)實(shí)驗(yàn)動物SPF級雄性SD大鼠120只，體重260-310g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。室溫20±3℃，濕度50±20％，并提供足量全營養(yǎng)鼠糧及清潔飲用水。
　　(2)實(shí)驗(yàn)器械流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，低溫冷凍高速離心機(jī)購自德國Hereaus公司，尼龍線栓購自北京沙東生物技術(shù)有限公司。
　　(3)實(shí)驗(yàn)

3、試劑2，3，5—氯化三苯基四氮唑(TTC)購于Sigma公司，大鼠淋巴細(xì)胞分離液(histopaque10831)購自美國Sigma公司。小鼠抗大鼠CD34單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗大鼠CD133多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自美國Proteintech公司。小鼠抗大鼠CD31單克隆抗

4、體購自英國Abcam公司，鏈霉親和素和生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。
　　2、實(shí)驗(yàn)方法
　　將大鼠隨機(jī)分為三組:假手術(shù)（Sham Operation，SP）組(n=36)、大腦中動脈閉塞（Middle Artery Occlusion，MCAO）組(n=42)、腦缺血預(yù)處理(BrainIschemic Preconditionging，BIP)組(n=42)，每組再分為缺血再灌注前0h、缺血再

5、灌注后3h、24h、3d、5d、7d六個時點(diǎn)，每個時點(diǎn)6只大鼠。應(yīng)用Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠不同時間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評分，應(yīng)用TTC染色法測量各組大鼠腦梗塞體積，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)各組大鼠不同時間點(diǎn)外周血EPCs數(shù)目，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠不同時間點(diǎn)缺血區(qū)腦組織新生血管密度。
　　3、統(tǒng)計學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±s)表示，多組間比較采用單因

6、素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析比較外周血EPCs與新生血管密度的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、神經(jīng)功能缺失評分SP組大鼠各時間點(diǎn)均未見神經(jīng)功能缺失。缺血再灌注前0h: MCAO組、BIP組均未見神經(jīng)功能缺失。再灌注后3h、24h、3d: BIP組及MCAO組均有不同程度的神經(jīng)功能缺失，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);再灌注后5d、7d: BIP組神經(jīng)功能缺失

7、評分明顯低于MCAO組(P＜0.05)。
　　2、腦梗塞體積再灌注后24h，MCAO組、BIP組均出現(xiàn)不同程度腦梗塞，且BIP組較MCAO組明顯降低(P＜0.05)。
　　3、外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目SP組大鼠各時間點(diǎn)外周血EPCs數(shù)目兩兩比較未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。MCAO組及BIP組EPCs數(shù)目在0h、3h較SP組無明顯變化（P＞0.05），此后MCAO組EPCs水平逐漸下降，在24h降至最低，之后逐漸上升，于7d時

8、回到SP組水平(P＞0.05)。再灌注后24h、3d、5d、7d: BIP組EPCs數(shù)目始終高于SP組(P＜0.01)，且BIP組始終高于MCAO組(P＜0.01)。
　　4、新生血管密度再灌注前0h、再灌注后24h:各組缺血區(qū)腦組織均未見新生血管。再灌注后3d:BIP組可見新生血管，而SP組、MCAO組均于再灌注后5d才可見新生血管。再灌注后5d、7d:BIP組及MCAO組新生血管數(shù)目明顯多于SP組(P＜0.01)，且BIP組多

9、于MCAO組(P＜0.01)。
　　5、使用Pearson相關(guān)性分析顯示，缺血再灌注后5d、7d:在BIP組和MCAO組中，外周血EPCs數(shù)目同缺血區(qū)腦組織的新生血管密度呈正相關(guān)(5d:r=0.855，P＜0.01;7d: r=0.946, P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、BIP能減小缺血/再灌注損傷大鼠腦梗死的體積，減輕大鼠神經(jīng)功能損傷程度，促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　2、腦缺血/再灌