間充質干細胞上清液對2,5-己二酮致PC12細胞凋亡的保護作用及其機制研究.pdf

1、目的:觀察間充質干細胞上清液(MSC-CM)對2，5-己二酮(HD)誘導PC12細胞凋亡的保護作用，并探討其作用機制。
　　材料和方法:體外培養(yǎng)、純化Wistar大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)，并收集其第5代MSC-CM。將實驗分為四組:①空白對照組:不對PC12細胞進行任何處理。②MSC-CM對照組:向PC12培養(yǎng)體系中加入40％的MSC-CM。③HD暴露組:PC12細胞暴露于20 mmol/L HD24 h，制備PC12細

2、胞損傷模型。④MSC-CM保護組:20 mmol/L HD作用于PC12細胞24 h后，分別加入10％、20％、40％體積的MSC-CM。以上各組用MTT法檢測細胞活性;Hoechst33342觀察細胞凋亡形態(tài)學改變，流式細胞儀檢測細胞凋亡率;Real-time RT-PCR檢測Bax、Bcl-2和BMSCs中NGF的表達;Westem-Blotting檢測Bax、Bcl-2、細胞色素C(cytochromec)以及BMSCs中NGF蛋

3、白表達量;rhodamine123法檢測線粒體膜電位(MMP)的變化;Bradford法檢測待測樣品單位蛋白中caspase-3活性;ELISA法對3-6代MSC-CM中NGF含量進行測定。
　　結果:1.MTT結果與空白對照組比較，MSC-CM對照組PC12細胞的活性無顯著差異(p＞0.05)，而HD暴露組的PC12細胞活性顯著降低(p＜0.05)。MSC-CM保護組與HD暴露組相比，PC12細胞活性明顯提高(p＜0.05)，且

4、呈劑量反應關系。2.細胞凋亡結果Hoechst33342觀察細胞凋亡形態(tài)改變，對照組細胞核核質均勻細胞核呈圓形或橢圓形，HD暴露組細胞呈新月形，核仁消失，染色質聚集移動，有特征性凋亡小體形成，而MSC-CM保護組PC12細胞特征性凋亡小體細胞有所減少;AV/PI雙染流式細胞儀對PC12細胞進行凋亡率的檢測中發(fā)現(xiàn)，HD暴露組PC12細胞的凋亡率較對照組顯著增加(p＜0.05)，加入MSC-CM后PC12細胞凋亡率逐漸降低。3.Bax、Bc

5、l-2的mRNA表達結果HD暴露組中，PC12細胞Bax的mRNA表達明顯高于對照組(p＜0.05)，而加入MSC-CM后Bax的mRNA表達較HD暴露組明顯降低(p＜0.05)，并且隨著MSC-CM體積的增加而降低;PC12細胞Bcl-2的mRNA表達，HD暴露組較對照組明顯降低(p＜0.05)，而MSC-CM保護組mRNA表達明顯高于HD暴露組(p＜0.05); Bax與Bcl-2 mRNA的比值，HD暴露組與空白對照組相比，比值明

6、顯增加(p＜0.05)，而MSC-CM保護組較HD暴露組比值降低(p＜0.05)。4.Bax、Bcl-2的蛋白表達結果HD暴露組PC12細胞Bax蛋白表達量顯著高于空白對照組(p＜0.05)，而MSC-CM組Bax的蛋白表達較HD暴露組有所降低(p＜0.05)，并且隨著MSC-CM體積的增加而減少;PC12細胞Bcl-2蛋白表達，HD暴露組中明顯低于空白對照組(p＜0.05)，MSC-CM保護組明顯高于HD暴露組(p＜0.05)，且隨著

7、MSC-CM體積分數(shù)的增加而增加;Bax與Bcl-2的比值Bax/Bcl-2，HD暴露組與空白對照組相比，其比值明顯增加(p＜0.05)，MSC-CM保護組較HD暴露組比值降低(p＜0.05)。5.MMP的檢測結果HD暴露組PC12細胞較空白對照組相比其線粒體膜電位顯著降低(p＜0.05)，MSC-CM保護組較HD暴露組逐漸增加，膜電位值由24.28％上升到38.15％、51.45％和66.47％。6.Cytochrome c的West

8、ern-Blotting結果線粒體內(nèi)cytochrome c蛋白表達，HD暴露組較空白對照組顯著降低(p＜0.05)，MSC-CM保護組與HD暴露組相比cytochrome c的蛋白表達明顯上升(p＜0.05);另一方面在胞漿中cytochromec的蛋白表達情況與在線粒體中相反。7.Caspase-3活性的檢測結果HD暴露組與對照組相比，PC12細胞caspase-3的活性顯著增加(p＜0.05)，而MSC-CM保護組與HD暴露組相比

9、活性降低(p＜0.05)。8.NGF水平的檢測結果BMSCs中NGF的mRNA在3到6代中均有所表達，而在第3代mRNA的表達量最高;蛋白表達量與Real-time RT-PCR結果相似;ELISA法測3到6代MSC-CM中NGF的含量根據(jù)相對曲線算出的MSC-CM中NGF相對值分別為52.41，49.17，24.11和23.38pg/ml。
　　結論:HD誘導PC12細胞凋亡;MSC-CM對HD誘導PC12細胞凋亡具有保護作用;