毛囊培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、目的：皮膚是人體最大的器官，在抵御微生物入侵，紫外線輻射以及防止水分的丟失、調(diào)節(jié)體溫方面起重要作用，同時(shí)也是免疫系統(tǒng)的組成部分之一。皮膚創(chuàng)傷后的再生以及修復(fù)，主要是由鄰近、健康的細(xì)胞分裂、增殖來實(shí)現(xiàn)的。但是大面積Ⅲ度燒傷、廣泛瘢痕切除、外傷性皮膚缺損以及皮膚潰瘍等導(dǎo)致的嚴(yán)重皮膚缺損，特別是大面積Ⅲ度燒傷，傷及皮膚全層及其附屬器，僅靠創(chuàng)面自身難以實(shí)現(xiàn)皮膚的再生，因而需要足夠的皮膚替代物進(jìn)行修復(fù)。雖然組織工程化皮膚是世界上第一種獲得批準(zhǔn)的組

2、織工程產(chǎn)品，并在治療頑固性潰瘍和嚴(yán)重?zé)齻颊叻矫嫒〉煤芎玫寞熜?，但是迄今未能合成含有皮膚附屬器(毛囊、汗腺、皮脂腺等)的皮膚。因此，目前尚無一種人工皮膚能完全滿足創(chuàng)面修復(fù)在功能上的需要，存在的一個(gè)共同問題是均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附屬器，降低了皮膚對環(huán)境的適應(yīng)能力，如何實(shí)現(xiàn)皮膚的功能重建成為當(dāng)前創(chuàng)傷修復(fù)的研究熱點(diǎn)。 干細(xì)胞理論技術(shù)的發(fā)展為在重建皮膚創(chuàng)傷組織解剖結(jié)構(gòu)的同時(shí)恢復(fù)其生理功能帶來了希望。干細(xì)胞具有終身、無限增殖

3、能力，而且在一定條件下，可以分化為各種功能的細(xì)胞。干細(xì)胞主要包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞兩大類。胚胎干細(xì)胞由于涉及倫理學(xué)問題，目前大規(guī)模的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用受到一定限制，因此成體干細(xì)胞的研究倍受重視。雖然近年來毛囊干細(xì)胞成為組織工程的新種子細(xì)胞備受關(guān)注，但是毛囊干細(xì)胞的分離純化技術(shù)還不完善，而且沒有建立完善的培養(yǎng)擴(kuò)增體系。在一定條件下，具有自我更新與多向分化潛能的成體干細(xì)胞即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，

4、MSCs)可以分化為同胚層的骨、軟骨、脂肪、心肌細(xì)胞以及肝細(xì)胞等，也可以跨胚層分化為肺上皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及表皮細(xì)胞等。由于MSCs取材方便，分離培養(yǎng)技術(shù)簡單，具有高度增殖性且體外培養(yǎng)時(shí)保持了生物學(xué)特性的穩(wěn)定，擴(kuò)增以及導(dǎo)入外源基因也相對方便，并且通過骨髓穿刺從自體獲得，因此由它誘導(dǎo)來的細(xì)胞在進(jìn)行移植時(shí)不存在組織配型及免疫排斥的問題，目前MSCs已成為細(xì)胞移植的首選靶細(xì)胞。有報(bào)道，MSCs經(jīng)自體移植作用于創(chuàng)面局部后，在皮膚微環(huán)

5、境中分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和皮脂腺導(dǎo)管細(xì)胞。因此，MSCs在未來的皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的實(shí)際應(yīng)用中具有潛在的優(yōu)勢。 MSCs分化的機(jī)理和誘導(dǎo)條件迄今為止還不清楚，大多數(shù)人認(rèn)為MSCs的分化與其所處的微環(huán)境“壁龕”密切相關(guān)，不同的組織細(xì)胞微環(huán)境有著不同的細(xì)胞因子，可能是誘導(dǎo)MSCs獲得靶組織的表型，并向不同細(xì)胞譜系分化的主要原因之一。已有研究證實(shí)，視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞與視細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)采用

6、毛囊培養(yǎng)上清液模擬體內(nèi)的微環(huán)境，探討MSCs是否具有向毛囊干細(xì)胞分化的潛能，從形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)以及基因表達(dá)等多個(gè)方面鑒定，從而探討MSCs在將來皮膚創(chuàng)傷修復(fù)實(shí)際應(yīng)用中的潛在優(yōu)勢，促使人們探討能否利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化來重建皮膚的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能。 方法 體重100g雄性Wistar大鼠脫頸椎處死，采用貼壁法，通過差速貼壁法去除非貼壁的造血細(xì)胞，獲得相對均質(zhì)的MSCs，細(xì)胞爬片，固定，進(jìn)行C

7、D44、CD29免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。無菌條件下，取上述同一只Wistar大鼠觸須部皮膚，用顯微外科器械分離毛囊于24孔培養(yǎng)板中，每天收集培養(yǎng)上清液，過濾后與DMEM培養(yǎng)液按2：3混合，用此混合培養(yǎng)液對第3代MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行K15、CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，然后利用RT-PCR進(jìn)一步檢測誘導(dǎo)后K15、CD34mRNA的表達(dá)。 結(jié)果

8、一、MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 MSCs原代培養(yǎng)接種后12h可見少數(shù)細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)呈成纖維樣細(xì)胞，并很快形成集落。24h后首次換液， 3天后細(xì)胞增殖加快，呈集落樣迅速生長，7天后細(xì)胞達(dá)到80％融合，2-3代后MSCs呈梭形，細(xì)胞核較大、核仁明顯，95％以上形態(tài)均勻一致，CD44、CD29免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞膜呈棕黃色。 二、毛囊的器官培養(yǎng)及觀察 毛囊接種培養(yǎng)后第1天，大部分毛囊開始生長，表現(xiàn)為毛囊逐漸

9、延長，生長延長主要集中在前4天，到第7天后部分毛囊開始貼壁，逐漸發(fā)現(xiàn)有成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞從毛囊長出，并逐漸增殖生長，呈鋪路石樣，到第10天以后毛囊大部分貼壁，生長緩慢，基本無變化。 三、MSCs在條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后的培養(yǎng)、觀察及鑒定 1、第3代MSCs經(jīng)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后第7天，可見少數(shù)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，隨著時(shí)間的延長，逐漸由原來的梭形向角質(zhì)樣細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變。 2、第3代MSCs誘導(dǎo)21天后，K15、CD34免

10、疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示部分陽性細(xì)胞，K15陽性率為62.8％，CD34陽性率為35.5％，未誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中CD34、K15呈陰性。 3、第3代MSCs體外誘導(dǎo)21天后，RT-PCR檢測CD34、K19表達(dá)陽性。 討論 大面積皮膚燒傷、慢性潰瘍、創(chuàng)傷、皮膚腫瘤切除或其它皮膚疾病，導(dǎo)致皮膚全層及其附屬器的嚴(yán)重缺損，需要足夠的皮膚替代物進(jìn)行修復(fù)。目前尚無一種人工皮膚能完全滿足創(chuàng)面修復(fù)在功能上

11、的需要，存在的一個(gè)共同問題是均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附屬器，降低了移植皮膚對外界環(huán)境的適應(yīng)能力，如何實(shí)現(xiàn)皮膚移植后的功能重建成為當(dāng)前創(chuàng)傷修復(fù)的研究熱點(diǎn)。 由于MSCs取材方便，分離培養(yǎng)技術(shù)簡單，具有高度增殖性且體外培養(yǎng)時(shí)保持了穩(wěn)定的生物學(xué)特性，擴(kuò)增以及導(dǎo)入外源基因也相對方便，由它誘導(dǎo)來的細(xì)胞在進(jìn)行移植時(shí)不存在組織配型及免疫排斥的問題，目前已成為組織工程中細(xì)胞移植的首選靶細(xì)胞。王海萍等利用5-氮胞苷(5-aza)誘導(dǎo)骨髓

12、間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室潘峰等成功地誘導(dǎo)MSCs向成骨樣細(xì)胞方向分化。已有研究證實(shí)MSCs經(jīng)自體移植作用于創(chuàng)面局部后，在皮膚微環(huán)境中分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和皮脂腺導(dǎo)管細(xì)胞。Nakagawa等人通過將MSCs種植到人工皮膚上以修復(fù)皮膚缺損的裸鼠，證實(shí)MSCs具有促進(jìn)傷口愈合的潛能。McFarlin等人將MSCs注射到皮膚損傷的部分，證實(shí)MSCs能有效促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合。雖然在皮膚組織工程中，毛囊干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的研究

13、已取得進(jìn)展，但是其分離和純化還有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)利用每天收集的毛囊培養(yǎng)上清液模擬體內(nèi)的微環(huán)境，毛囊器官培養(yǎng)過程中分泌的細(xì)胞因子(KCF、FGF、VEGF等)不斷作用于MSCs，培養(yǎng)3周后可以看到誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有典型的角質(zhì)樣細(xì)胞的形態(tài)特征，呈多角形，胞核偏大，特異性地表達(dá)K15、CD34，K15、CD34是近兩年來發(fā)現(xiàn)的在毛囊干細(xì)胞高表達(dá)的分子標(biāo)記，表明在毛囊培養(yǎng)液的誘導(dǎo)下，MSCs具有向毛囊干細(xì)胞分化的潛能，為誘導(dǎo)MSCs進(jìn)一步分

14、化為表皮、真皮以及皮膚附屬器奠定了基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)利用毛囊培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)MSCs分化為毛囊干細(xì)胞樣的細(xì)胞，使得合成具有完整解剖結(jié)構(gòu)和良好功能的皮膚成為可能。本實(shí)驗(yàn)初步證明了在體外的誘導(dǎo)條件下，MSCs具有向毛囊干細(xì)胞分化的巨大潛能，并且為進(jìn)一步分化為表皮、真皮和皮膚附屬器的研究奠定了基礎(chǔ)，但是，MSCs誘導(dǎo)后進(jìn)一步分化為皮膚附屬器的可能性需進(jìn)一步做嚴(yán)格的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行深入細(xì)致的探究，另外，MSCs向毛囊干細(xì)胞分化的分子機(jī)制以及分化