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文檔簡介
1、背景:潰瘍性結(jié)腸炎(UC)以腸道慢性炎癥為特征,屬于炎癥性腸?。↖BD)的一種亞型,發(fā)病機(jī)制尚不清楚。腸道上皮細(xì)胞(IECs)構(gòu)成的腸粘膜屏障在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的天然免疫屏障功能。淋巴毒素介導(dǎo)的免疫反應(yīng)通過其主要識別受體LTβR誘導(dǎo)固有及適應(yīng)性免疫反應(yīng),參與腸道炎癥的發(fā)展過程。然而,尚缺乏三者在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的研究。
第一部分:淋巴毒素對腸道炎癥的影響
目的:研究淋巴毒素對腸道炎癥的影響及相關(guān)細(xì)胞因子
2、的表達(dá)。方法:1.采用HT-29細(xì)胞株模擬人類正常腸上皮細(xì)胞,給予淋巴毒素(LTα1/β2)刺激,通過增殖及凋亡試劑盒檢測HT-29細(xì)胞的增殖與凋亡情況的變化,記錄其遷移情況的變化,并使用Western-blot和Real-time PCR技術(shù)方法檢測淋巴毒素及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情況;2.通過免疫組織化學(xué)方法對人類腸道組織中的淋巴毒素與炎癥評分進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果:1.在HT-29細(xì)胞中,加藥組細(xì)胞的增殖較對照組減低明顯,細(xì)胞凋亡較對照
3、組增多,遷移較對照組減慢(*P<0.05,**P<0.01),并呈時間-劑量依賴性;2.在HT-29細(xì)胞中,加藥組cmyc增殖基因與bcl-2抗凋亡基因均較對照組減少,凋亡基因caspase-9較對照組增多(**P<0.01);3.在HT-29細(xì)胞中,加藥組細(xì)胞的炎癥因子 TNFα較對照組增多(*P<0.05,**P<0.01),粘膜保護(hù)因子(CLAUDIN2,DMBT1,MUC1)較對照組減少(**P<0.01);4.在人類腸道粘膜組
4、織中,UC患者的淋巴毒素表達(dá)量經(jīng)Real-time PCR、Western-blot及免疫組織化學(xué)法檢測均較正常對照組增多(**P<0.01);5.通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)LTα1/β2主要由CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞分泌。6.在UC患者腸道粘膜組織的Real-time PCR檢測中,淋巴毒素表達(dá)量與Geboes評分呈正相關(guān)。結(jié)論:淋巴毒素可加重腸道炎癥及相關(guān)炎癥因子的表達(dá),破壞腸粘膜屏障及其通透性,抑制HT-29細(xì)
5、胞損傷后再修復(fù),提示其在UC發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。
第二部分:淋巴毒素通過淋巴毒素受體LTβR誘導(dǎo)腸道炎癥的發(fā)生
目的:探討淋巴毒素受體對結(jié)腸上皮內(nèi)炎癥的調(diào)控。方法:1.使用淋巴毒素刺激HT-29細(xì)胞,采用Real-time PCR方法檢測淋巴毒素受體的變化;2.采用免疫組織化學(xué)法及Western-blot方法檢測人類腸道組織中淋巴毒素受體的表達(dá)量變化;3.在UC患者腸道粘膜組織中,使用免疫熒光共聚焦方法確定表
6、達(dá)淋巴毒素受體的細(xì)胞。結(jié)果:1.在人類腸道粘膜組織的免疫組織化學(xué)染色和Western-blot檢測中,淋巴毒素受體的表達(dá)數(shù)量高于正常對照組(**P<0.01),并采用免疫熒光共聚焦檢測到HT-29細(xì)胞表面表達(dá)LTβR;2.在UC患者的腸道粘膜組織中,淋巴毒素受體主要表達(dá)于腸粘膜上皮細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中。結(jié)論:淋巴毒素可能主要通過識別腸道粘膜上皮細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的淋巴毒素受體,激活下游炎癥通路,誘導(dǎo)加重UC腸道炎癥的發(fā)生發(fā)
7、展。
第三部分淋巴毒素受體參與結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的信號通路調(diào)控
目的:研究淋巴毒素受體是否經(jīng) NF-κB途徑炎癥信號通路加重 UC腸道炎癥。方法:1.通過IMD0354阻斷HT-29細(xì)胞中NF-κB信號通路,再將LTα1/β2加入細(xì)胞共培養(yǎng),檢測相關(guān)炎癥因子和粘膜保護(hù)因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平,及增殖和凋亡基因表達(dá)水平;2.通過采用Western-blot方法檢測人類腸道粘膜組織中NF-κB途徑炎癥信號通路中相關(guān)
8、蛋白激酶磷酸化的表達(dá)量。結(jié)果:1.IMD0354阻斷 HT-29細(xì)胞中NF-κB信號通路后,炎癥因子較阻斷組減少(**P<0.01),粘膜保護(hù)因子較多(**P<0.01),增殖(*P<0.05)和抗凋亡基因表達(dá)較多(**P<0.01),凋亡基因表達(dá)較少(**P<0.01);2.UC患者腸道粘膜組織中NF-κB途徑炎癥信號通路中相關(guān)蛋白激酶磷酸化程度的表達(dá)量高于正常對照組(**P<0.01)。結(jié)論:淋巴毒素受體可能是通過NF-κB途徑炎癥
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