淋巴毒素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎腸道粘膜免疫的影響.pdf

1、背景：潰瘍性結(jié)腸炎(UC）以腸道慢性炎癥為特征，屬于炎癥性腸病（IBD）的一種亞型，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。腸道上皮細(xì)胞（IECs）構(gòu)成的腸粘膜屏障在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的天然免疫屏障功能。淋巴毒素介導(dǎo)的免疫反應(yīng)通過(guò)其主要識(shí)別受體LTβR誘導(dǎo)固有及適應(yīng)性免疫反應(yīng)，參與腸道炎癥的發(fā)展過(guò)程。然而，尚缺乏三者在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的研究。
　　第一部分：淋巴毒素對(duì)腸道炎癥的影響
　　目的：研究淋巴毒素對(duì)腸道炎癥的影響及相關(guān)細(xì)胞因子

2、的表達(dá)。方法：1.采用HT-29細(xì)胞株模擬人類正常腸上皮細(xì)胞，給予淋巴毒素（LTα1/β2）刺激，通過(guò)增殖及凋亡試劑盒檢測(cè)HT-29細(xì)胞的增殖與凋亡情況的變化，記錄其遷移情況的變化，并使用Western-blot和Real-time PCR技術(shù)方法檢測(cè)淋巴毒素及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情況；2.通過(guò)免疫組織化學(xué)方法對(duì)人類腸道組織中的淋巴毒素與炎癥評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：1.在HT-29細(xì)胞中，加藥組細(xì)胞的增殖較對(duì)照組減低明顯，細(xì)胞凋亡較對(duì)照

3、組增多，遷移較對(duì)照組減慢（*P<0.05,**P<0.01），并呈時(shí)間-劑量依賴性；2.在HT-29細(xì)胞中，加藥組cmyc增殖基因與bcl-2抗凋亡基因均較對(duì)照組減少，凋亡基因caspase-9較對(duì)照組增多（**P<0.01）；3.在HT-29細(xì)胞中，加藥組細(xì)胞的炎癥因子 TNFα較對(duì)照組增多（*P<0.05,**P<0.01），粘膜保護(hù)因子（CLAUDIN2，DMBT1，MUC1）較對(duì)照組減少（**P<0.01）；4.在人類腸道粘膜組

4、織中，UC患者的淋巴毒素表達(dá)量經(jīng)Real-time PCR、Western-blot及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)均較正常對(duì)照組增多（**P<0.01）；5.通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LTα1/β2主要由CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞分泌。6.在UC患者腸道粘膜組織的Real-time PCR檢測(cè)中，淋巴毒素表達(dá)量與Geboes評(píng)分呈正相關(guān)。結(jié)論：淋巴毒素可加重腸道炎癥及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，破壞腸粘膜屏障及其通透性，抑制HT-29細(xì)

5、胞損傷后再修復(fù)，提示其在UC發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。
　　第二部分：淋巴毒素通過(guò)淋巴毒素受體LTβR誘導(dǎo)腸道炎癥的發(fā)生
　　目的：探討淋巴毒素受體對(duì)結(jié)腸上皮內(nèi)炎癥的調(diào)控。方法：1.使用淋巴毒素刺激HT-29細(xì)胞，采用Real-time PCR方法檢測(cè)淋巴毒素受體的變化；2.采用免疫組織化學(xué)法及Western-blot方法檢測(cè)人類腸道組織中淋巴毒素受體的表達(dá)量變化；3.在UC患者腸道粘膜組織中，使用免疫熒光共聚焦方法確定表

6、達(dá)淋巴毒素受體的細(xì)胞。結(jié)果：1.在人類腸道粘膜組織的免疫組織化學(xué)染色和Western-blot檢測(cè)中，淋巴毒素受體的表達(dá)數(shù)量高于正常對(duì)照組（**P<0.01），并采用免疫熒光共聚焦檢測(cè)到HT-29細(xì)胞表面表達(dá)LTβR；2.在UC患者的腸道粘膜組織中，淋巴毒素受體主要表達(dá)于腸粘膜上皮細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中。結(jié)論：淋巴毒素可能主要通過(guò)識(shí)別腸道粘膜上皮細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的淋巴毒素受體，激活下游炎癥通路，誘導(dǎo)加重UC腸道炎癥的發(fā)生發(fā)

7、展。
　　第三部分淋巴毒素受體參與結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路調(diào)控
　　目的：研究淋巴毒素受體是否經(jīng) NF-κB途徑炎癥信號(hào)通路加重 UC腸道炎癥。方法：1.通過(guò)IMD0354阻斷HT-29細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路，再將LTα1/β2加入細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)相關(guān)炎癥因子和粘膜保護(hù)因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平，及增殖和凋亡基因表達(dá)水平；2.通過(guò)采用Western-blot方法檢測(cè)人類腸道粘膜組織中NF-κB途徑炎癥信號(hào)通路中相關(guān)

8、蛋白激酶磷酸化的表達(dá)量。結(jié)果：1.IMD0354阻斷 HT-29細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路后，炎癥因子較阻斷組減少（**P<0.01），粘膜保護(hù)因子較多（**P<0.01），增殖(*P<0.05)和抗凋亡基因表達(dá)較多（**P<0.01），凋亡基因表達(dá)較少（**P<0.01）；2.UC患者腸道粘膜組織中NF-κB途徑炎癥信號(hào)通路中相關(guān)蛋白激酶磷酸化程度的表達(dá)量高于正常對(duì)照組（**P<0.01）。結(jié)論：淋巴毒素受體可能是通過(guò)NF-κB途徑炎癥