2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染在人群中普遍存在,一般呈隱性感染狀態(tài),多數(shù)感染者為健康的病毒攜帶者。但HCMV先天感染及免疫能力低下的人群感染,其發(fā)病率和死亡率則顯著提高(1),且致病機(jī)理尚不清楚。HCMV是目前唯一被證實(shí)具有編碼miRNA能力的β皰疹病毒,研究表明,miRNA對細(xì)胞分化、增殖、凋亡、致癌等生物過程有調(diào)節(jié)作用(2-6)。近年來,HCMV編碼miRNA對基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)

2、控的研究也成為HCMV致病機(jī)理研究的熱點(diǎn)。
  迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HCMV至少編碼26種成熟的miRNAs(7),這些miRNAs在HCMV感染過程中作用于mRNA使其蛋白質(zhì)翻譯終止甚至降解。例如miRNA-UL112-1通過下調(diào)HCMV IE72(UL123,IE1),UL112/113,UL120/121以及UL144的表達(dá)進(jìn)而影響病毒的復(fù)制能力(8-9);同時miRNA-UL112-1還可通過與人組織相容性復(fù)合體Ⅰ類相關(guān)基因B

3、(major histocompatibility complex classⅠ-related chain B,MICB)相互作用,從而逃避NK細(xì)胞的識別(10)。由此可見,HCMV利用自身編碼的miRNAs調(diào)節(jié)自身及宿主細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)而完成病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及免疫逃避等過程。
  miR-US33-5p和miR-UL36-5p是HCMV編碼的miRNAs中較早發(fā)現(xiàn)的兩個miRNAs。有研究指出miR-US33可減少潛伏狀

4、態(tài)下HCMV DNA復(fù)制(11),然而,其機(jī)制尚未明確。也有文獻(xiàn)報道使用hybrid PCR方法篩選出solute carrierfamily25,member6(SLC25A6,又名腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶adenine nucleotidetranslocator3,ANT3)為miR-UL36-5p候選靶基因(12)。為進(jìn)一步明確miR-US33-5p及miR-UL36-5p的生物學(xué)功能,本研究擬采用hybrid PCR(13)、熒光素

5、酶活性檢測實(shí)驗(yàn)及免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)等方法來鑒定與miR-US33-5p和miR-UL36-5p相互作用的靶基因。并針對不同靶基因的生物學(xué)功能設(shè)計不同的功能研究實(shí)驗(yàn)路線,明確miR-US33-5p和miR-UL36-5p在HCMV感染過程中的生物學(xué)功能。
  方法:
  一、實(shí)驗(yàn)材料
  1、HCMV臨床分離株Han、HCMV han株細(xì)菌人工染色體(HCMV han BAC)
  2、人胚腎

6、細(xì)胞HEK293、人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5和HELF、人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373
  3、核酸提取相關(guān)試劑
  4、熒光定量PCR檢測相關(guān)試劑
  5、構(gòu)建表達(dá)載體相關(guān)試劑
  6、雙螢光素酶報告基因檢測相關(guān)試劑
  7、Western blot印跡雜交相關(guān)試劑
  8、Power SYBR Green PCR檢測相關(guān)試劑
  9、凋亡檢測相關(guān)試劑
  10、常用實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括熒光分光光度

7、計、紫外分光光度計、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、自動凝膠成像分析儀、全溫振蕩培養(yǎng)箱等。
  11、常用數(shù)據(jù)庫及分析軟件包括基因組數(shù)據(jù)庫、凝膠成像及掃描分析軟件、引物設(shè)計軟件(Primer5)、SPSS version13.0等。
  二、實(shí)驗(yàn)方法
  人巨細(xì)胞病毒miR-US33-5p靶基因的鑒定及功能研究
  1、采用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞中miR-US33-5p的表達(dá)。
  2、

8、采用hybrid PCR方法篩選HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞中miR-US33-5p靶基因。
  3、將hybrid PCR方法獲得的靶基因以及生物信息學(xué)軟件預(yù)測的靶基因的miR-US33-5p結(jié)合區(qū)及其附近400bp左右的序列構(gòu)建到pMIR-REPORTERTMLuciferase載體中,通過熒光素酶活性檢測熒光值的變化判斷miR-US33-5p與候選靶基因3'-UTR的結(jié)合能力,并確定與病毒復(fù)制相關(guān)的靶基因突觸融合蛋白synt

9、axin3(STX3)。
  4、構(gòu)建STX33'-UTR突變型熒光素酶報告基因表達(dá)載體,應(yīng)用熒光素酶活性檢測,進(jìn)一步驗(yàn)證miR-US33-5p與STX33'-UTR的直接結(jié)合作用。
  5、通過western blot方法檢測miR-US33-5p對HCMV感染刺激下MRC-5細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性STX3蛋白表達(dá)水平的影響。
  6、利用定量PCR(qPCR)方法檢測體外過表達(dá)miR-US33-5p靶向調(diào)控STX3表達(dá)對

10、HCMV DNA拷貝數(shù)的影響。
  7、繪制過表達(dá)miR-US33-5p的HCMV病毒生長曲線,明確miR-US33-5p與病毒復(fù)制的關(guān)系。
  人巨細(xì)胞病毒miR-UL36-5p靶基因的鑒定及功能研究
  1、將已知的miR-UL36-5p候選靶基因腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶ANT3與miR-UL36-5p的結(jié)合區(qū)及其附近267bp的序列構(gòu)建到pMIR-REPORTERTMLuciferase載體中,通過熒光素酶活性檢測熒光

11、值的變化判斷miR-UL36-5p與候選靶基因腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶ANT33'-UTR的結(jié)合能力。
  2、構(gòu)建ANT33'-UTR突變型熒光素酶報告基因表達(dá)載體,應(yīng)用熒光素酶活性檢測,進(jìn)一步驗(yàn)證miR-UL36-5p對ANT33'-UTR的直接結(jié)合作用。
  3、通過western blot方法檢測miR-UL36-5p對HEK-293、HELF及U373等三種不同細(xì)胞系內(nèi)源性表達(dá)的ANT3蛋白質(zhì)水平的影響;以及在HCMV感

12、染的HELF細(xì)胞中,ANT3蛋白表達(dá)水平的差異。
  4、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)miR-UL36-5p對細(xì)胞凋亡的影響。
  結(jié)果:
  一、人巨細(xì)胞病毒miR-US33-5p靶基因的鑒定及功能研究
  1、通過Taqman實(shí)時熒光定量PCR檢測,觀察到miR-US33-5p的表達(dá)量隨病毒培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加。
  2、經(jīng)過hybrid PCR篩選,共得到12個候選靶基因,涉及到免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)

13、合成、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、能量代謝、以及癌癥發(fā)生甚至HCMV病毒復(fù)制等方面。這些候選靶基因中有2個來源于病毒基因組,另外10個均來源于宿主基因。
  3、熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,8個hybrid PCR方法獲得的候選靶基因及2個預(yù)測的候選靶基因中,miR-US33-5p對其中7個候選靶基因發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用,且有統(tǒng)計學(xué)意義。其中與HCMV病毒復(fù)制相關(guān)的靶基因突觸融合蛋白STX33'-UTR與miR-US33-5p結(jié)合能力較強(qiáng),而miR-U

14、S33-5p針對STX33'-UTR突變型的負(fù)調(diào)控能力消失。
  4、對靶基因STX3進(jìn)行了蛋白表達(dá)水平的檢測,結(jié)果表明STX3蛋白的表達(dá)水平被miR-US33-5p下調(diào),證實(shí)STX3是miR-US33-5p的直接靶基因。
  5、通過實(shí)時定量HCMV編碼UL83基因DNA表達(dá)量的實(shí)驗(yàn)證實(shí),過表達(dá)miR-US33-5p能抑制HCMV DNA合成。進(jìn)一步繪制了HCMV生長曲線,結(jié)果表明過表達(dá)miR-US33-5p抑制HCMV復(fù)

15、制。
  二、人巨細(xì)胞病毒miR-UL36-5p靶基因的鑒定及功能研究
  1、熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示候選靶基因腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶ANT3明顯受到miR-UL36-5p的負(fù)調(diào)控,而miR-UL36-5p針對ANT33'-UTR突變型的負(fù)調(diào)控能力消失。
  2、對靶基因ANT3進(jìn)行了蛋白表達(dá)水平的檢測,結(jié)果顯示HEK-293、HELF及U373三種不同細(xì)胞系表達(dá)的ANT3水平均被miR-UL36-5p明顯下調(diào),證實(shí)AN

16、T3是miR-UL36-5p的直接靶基因。
  3、HCMV感染下調(diào)ANT3蛋白水平,其中感染24小時下調(diào)最明顯。
  4、流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-UL36-5p靶向下調(diào)ANT3表達(dá)明顯抑制饑餓誘導(dǎo)的三種不同細(xì)胞的凋亡。
  結(jié)論:
  1、人巨細(xì)胞病毒miR-US33-5p靶向作用突觸融合蛋白STX33'-UTR特定區(qū)域,負(fù)性調(diào)控該基因的表達(dá),進(jìn)一步影響HCMV DNA合成和DNA復(fù)制。
  2、

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