人巨細胞病毒RL13基因轉(zhuǎn)錄和mRNA結(jié)構(gòu)以及UL141基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、目的：
　　 人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是導致新生兒先天畸形和出生缺陷的首要感染因素，其危害巨大，給家庭和社會帶來巨大負擔。關(guān)于HCMV先天感染致病機理的研究已經(jīng)成為兒科學和人類病毒學領(lǐng)域中一項重要課題。HCMV在宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達有一定時序性，不同時期的表達產(chǎn)物可能在病毒復制周期中執(zhí)行不同功能。認識基因的轉(zhuǎn)錄方式及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對于全面認識HCMV基因生物學功能，進而揭示HCMV致病機理具

2、有重要意義。RL13基因是HCMV基因組中的一員，在成纖維細胞中能夠抑制病毒復制，目前RL13基因在臨床株中轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)尚未明確，本文采用cDNA文庫篩選，Northern blot及cDNA末端快速擴增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）等實驗方法，對RL13基因在一株臨床株中的轉(zhuǎn)錄情況進行研究。UL141基因位于HCMV UL/b'區(qū)，是HCMV基因組中一個重要的免疫調(diào)節(jié)基因。我們在前期研究中

3、發(fā)現(xiàn)，在不同分離株中存在多種起始位置不同的UL141基因轉(zhuǎn)錄本。這種轉(zhuǎn)錄起始位置的差異提示UL141基因不同轉(zhuǎn)錄本的表達調(diào)控存在差異。本研究采用熒光素酶報告基因表達檢測實驗，競爭性EMSA及酵母單雜交篩選對UL141基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行了研究。
　　 實驗材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 所用病毒株為中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病毒研究室保存的HCMV臨床低傳代分離株H和CH;人胚肺成纖維細胞（human emb

4、ryonic lung fibroblast，HELF）MRC-5購自中科院上海細胞庫;HCMV H株晚期cDNA文庫及HCMV-人胚肺細胞cDNA酵母表達文庫為中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病毒研究室構(gòu)建和保存;DIGNorthern Starter Kit購自Roche公司，3'-Full RACE Core Set Ver.2.0及5'-Full Race Kit購自TakaRa公司，pGL3熒光素酶報告基因載體質(zhì)粒、Dual-Luci

5、ferase? ReporterAssay System、DNA Purification System及Plasmid DNA Purification System購自Promega公司;引物合成及測序由Invitrogen公司完成;常用實驗設(shè)備包括Beckman臺式低溫高速離心機、Bio-rad PCR循環(huán)儀、細胞培養(yǎng)箱等;所用數(shù)據(jù)庫及分析軟件包括基因組數(shù)據(jù)庫、引物設(shè)計軟件、序列分析軟件等。
　　 二、實驗方法
　　

6、 （一）cDNA文庫篩選
　　 設(shè)計RL13基因特異性引物，運用PCR技術(shù)依次從cDNA文庫三級、二級、一級模板和單克隆中篩選出含有RL13基因序列的陽性克隆。
　　 （二）Northern blot
　　 合成RL13基因特異性RNA探針，應用NortheRN blot技術(shù)檢測RL13基因在病毒感染不同時期的轉(zhuǎn)錄時序和轉(zhuǎn)錄本的長度。
　　 （三）3'RACE和5'RACE
　　 通過3'RAC

7、E及5'RACE獲得RL13基因轉(zhuǎn)錄本確切的5'端及3'端序列。
　　 （四）熒光素酶報告基因表達檢測實驗
　　 1、構(gòu)建熒光素酶報告基因載體-轉(zhuǎn)錄本非編碼序列質(zhì)粒，研究UL141基因上游非編碼序列是否具有啟動子活性。
　　 2、采用5'缺失突變技術(shù)，鑒定具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力的片段，并確定調(diào)控元件核心序列。
　　 3、構(gòu)建調(diào)控元件-異源啟動子-熒光素酶報告基因質(zhì)粒，觀察調(diào)控序列對異源啟動子的作用，進一步確定調(diào)

8、控元件的調(diào)控能力。
　　 （五）電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)
　　 1、人工合成生物素標記和非標記的調(diào)控序列，同時提取MRC-5細胞核蛋白
　　 2、按照試劑盒說明書配置體系，孵育20min，同時將非變性聚丙烯酰胺凝膠進行預電泳100V，1h。
　　 3、上樣后電泳100V，45min。
　　 4、電壓100V，轉(zhuǎn)膜45min

9、。
　　 5、紫外交聯(lián)10min，逐步洗膜后進行ECL發(fā)光，分析結(jié)果。
　　 （六）酵母單雜交篩選
　　 應用人工合成結(jié)合同尾酶法構(gòu)建酵母單雜交系統(tǒng)報道子，轉(zhuǎn)化Y187酵母細胞。擴增HCMV-人胚肺細胞cDNA酵母表達文庫并提取質(zhì)粒，將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有報道子的酵母細胞，將含有兩種質(zhì)粒的酵母細胞在適當培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從平板上長出的克隆中提取酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定并測序，根據(jù)獲得的cDNA序列確定與報道子結(jié)合的

10、蛋白。
　　 結(jié)果：
　　 一、cDNA文庫篩選
　　 從cDNA文庫中共篩選出20個含有RL13特異序列的陽性cDNA克隆，共包含7種不同長度的轉(zhuǎn)錄本，長度分別為3628，3114，2515，2443，1737，1240和1029個核苷酸(nucleotide，nt)。這7種轉(zhuǎn)錄本具有相同的3'末端，不同的5'末端。
　　 二、Northern blot檢測
　　 在H株的感染晚期(late，L

11、) RNA中共檢測到8種RL13基因轉(zhuǎn)錄本。其中2種轉(zhuǎn)錄本（3114nt及2515-2443nt）在病毒感染的早期(early,E)開始出現(xiàn)，晚期(late，L)達到高峰。
　　 三、5'RACE及3'RACE
　　 RACE實驗結(jié)果表明，RL13基因轉(zhuǎn)錄本具有相同的3'末端和不同的5'末端。同HCMV Towne株(No.FJ61628)比較，3'末端位于第11717位核苷酸，5'末端分別位于第8132，8643，92

12、98，10493，10704和10886位核苷酸，結(jié)合3'RACE及5'RACE結(jié)果，RACE實驗共鑒定出6種轉(zhuǎn)錄本，長度分別為3628，3114，2459，1240，1029和846個核苷酸。
　　 四、RL13 ORF基因進化分析
　　 進行比對的7株（H，CH，Towne，TB40/E，Toledo，Merlin及AD169）分為3組，RL13開放閱讀碼框架（Open reading frame，ORF）的一致性在

13、15.7-99.3％之間，其中H株與Towne株的一致性為90.3％。
　　 五、熒光素酶報告基因表達檢測實驗
　　 1、UL141基因上游1499bp非編碼序列具有啟動子活性。
　　 2、確定了一個33bp的正調(diào)控元件及一個33bp負調(diào)控元件。
　　 3、證實了調(diào)控元件對異源啟動子具有調(diào)控作用。
　　 六、競爭性EMSA實驗
　　 EMSA結(jié)果表明，人胚肺細胞核蛋白中含有正、負調(diào)控序列的

14、結(jié)合蛋白，此種結(jié)合可以被同源序列競爭，說明結(jié)合蛋白與調(diào)控序列的結(jié)合為特異性結(jié)合。
　　 七、酵母單雜交
　　 應用酵母單雜交技術(shù)從HCMV-人胚肺細胞cDNA酵母文庫中篩選出一些分別可與正、負調(diào)控元件相結(jié)合的候選轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 通過cDNA文庫篩選，Northern blot，RACE等實驗證實HCMV RL13基因在E期開始轉(zhuǎn)錄，L期轉(zhuǎn)錄達到高峰，推測其是L期基因。HCMV RL13

15、基因至少有7種轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)，這些轉(zhuǎn)錄本均為非拼接結(jié)構(gòu)，具有相同的3'末端，不同的5'末端，長度分別為3628、3114、2515-2443、1737、1240、1029和846nt。
　　 通過熒光素酶報告基因檢測實驗確定了UL141基因上游非編碼區(qū)1499bp片段具有啟動子活性，并且發(fā)現(xiàn)了一個正調(diào)控元件及一個負調(diào)控元件;通過EMSA證實了正、負調(diào)控序列可與MRC-5細胞核蛋白相結(jié)合，從而調(diào)控UL141基因的轉(zhuǎn)錄;通過酵母單雜交技