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文檔簡介
1、目的:
為進一步對US12基因功能進行初步研究,利用Han-wt-BAC,構(gòu)建US12基因缺失BAC克隆,電轉(zhuǎn)人胚肺成纖維細胞(HELF),病毒成功包裝獲得Han-△US12-BAC毒。Han-△US12-BAC毒與Han-wt-BAC毒按照MOI0.1蝕斑形成單位/細胞接毒感染HELF,不同時間點收病毒上清,進行病毒樣本滴度測定,繪制生長曲線,對兩株病毒在HELF中的復(fù)制水平進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Han US12缺失BAC株與
2、Han野毒BAC株在HELF中生長擴散并無明顯差異,提示US12是HCMV Han在HELF中復(fù)制與擴散中的非必需基因。
方法:
一、實驗材料
HCMV低傳代分離株Han為中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室分離并保存;細胞株HELF、HCMV實驗室株AD169由羅敏華教授惠贈;BAC體系相關(guān)實驗材料由朱樺博士惠贈;HCMV Han-wt-BAC為羅敏華教授課題組與我室共同構(gòu)建;HCMV Han-wt-BAC
3、病毒株已成功包裝并保存;HCMV Han株cDNA文庫為本室構(gòu)建并保存;引物合成及測序由Invitrogen公司完成;常用實驗設(shè)備包括Tanon凝膠成像分析系統(tǒng)、Beckman臺式低溫高速離心機、Bio-rad PCR循環(huán)儀、BioRad電轉(zhuǎn)儀、生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡等;所用生物信息學(xué)軟件主要包括序列比對軟件BLAST、引物設(shè)計軟件primer premier5.0、序列分析軟件包DNAstar等。
二、實驗方
4、法
?。ㄒ唬ヽDNA文庫篩選
設(shè)計US12基因特異性文庫擴增引物,應(yīng)用菌液PCR依次從cDNA文庫三級、二級、一級模板和單克隆中篩選出含有US12 cDNA序列的陽性克隆并測序。
?。ǘ㎞orthern blot
制備Han株與AD169株感染HELF后IE,E,L期及mock對照總RNA樣本。設(shè)計并合成US12-US17基因特異性RNA探針,應(yīng)用Northern印記雜交技術(shù)檢測Han與AD169株
5、US12-US17基因區(qū)在病毒感染不同時期的轉(zhuǎn)錄時序和轉(zhuǎn)錄本的長度。
?。ㄈ㏑T-PCR
為鑒定US12-US17基因區(qū)是否存在內(nèi)含子,應(yīng)用US12-R/US14-LF,US14-LR/US15-F與US15-R/US17-F三對引物RT-PCR擴增Han株晚期RNA。將Han株RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,分別以Han cDNA及Han基因組為模板,PCR擴增,根據(jù)其產(chǎn)物片段大小比較,確認在US12-US17區(qū)是否存在剪
6、切轉(zhuǎn)錄形式。
?。ㄋ模?' RACE和5'RACE
針對Northern blot檢測到的所有US12-US17基因區(qū)轉(zhuǎn)錄本,通過3'RACE及5'RACE獲得這些全長轉(zhuǎn)錄本的3'端和5'端序列及在Han株與AD169株基因組中的定位。
(五)US12缺失BAC克隆構(gòu)建
首先制備E.coli DY380-Han-wt-BAC電轉(zhuǎn)感受態(tài)。以pGEM-oriV/Kan質(zhì)粒為模板,PCR擴增卡那抗性基因,
7、DpnⅠ酶切并純化,電轉(zhuǎn)E.coli DY380-Han-wt-BAC感受態(tài),卡那霉素LB平板篩選正確重組單克隆,PCR鑒定及測序驗證。經(jīng)驗證的單克隆擴增搖菌,提取Han-△US12-BAC質(zhì)粒。
(六)Han-△US12-BAC毒在HELF中包裝
Han-△US12-BAC質(zhì)粒電轉(zhuǎn)HELF,通過綠色熒光蛋白(green fluorescenceprotein,GFP)表達及細胞病變效應(yīng)(cytopathic eff
8、ect,CPE)出現(xiàn),驗證是否正確包裝為感染性病毒。CPE達到100%后,傳代擴增毒株。
(七)Han-△US12-BAC毒及Han-wt-BAC毒生長曲線實驗
TCID50法測定Han-△US12-BAC毒及Han-wt-BAC毒滴度。按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為0.1 pfu/cell接毒于HELF,感染后0、2、4、6、8、10、12天分別收病毒上清液。收毒標本T
9、CID50法測滴度,繪制生長曲線。
?。ò耍┥镄畔W(xué)分析
引物設(shè)計應(yīng)用Primer premier5.0,序列比對應(yīng)用BLAST,DNA序列分析及蛋白特性分析應(yīng)用BioEdit5.0.0與DNAStar5.1。
結(jié)果:
一、cDNA文庫篩選
從HCMV Han株晚期cDNA文庫中共篩選出23個含有US12特異序列的陽性cDNA克隆。一個克隆檢測到定位于Han株核苷酸位點(nucleoti
10、de,nt)208816-207055的1762bp轉(zhuǎn)錄本,是涵蓋US12、US13 ORF序列的雙順反子。其它22個陽性克隆為890bp cDNA序列,僅包含US12基因,為單順反子轉(zhuǎn)錄本。5'端定位于nt207945-207948,3'端定位于nt207055-207062。
二、Northern blot檢測
應(yīng)用US12-P在Han株感染HELF的L期RNA中共檢測到6條轉(zhuǎn)錄本,長度分別約為4600nt,36
11、00nt,2800nt,2100nt,1800nt及900nt,在AD169株L期RNA中除以上六條轉(zhuǎn)錄本外,另檢測到一條約5600nt的轉(zhuǎn)錄本。而在IE,E期RNA與mock對照組RNA中未鑒定到任何轉(zhuǎn)錄本。在這些轉(zhuǎn)錄本中,900nt轉(zhuǎn)錄本表達豐度最高,1800nt轉(zhuǎn)錄本次之。
應(yīng)用US12-US17基因區(qū)各個基因特異性探針US12-P,US13-P,US14-LP,US14-UP,US15-P,US16-P與US17-P檢
12、測Han株晚期RNA,不同探針鑒定到的轉(zhuǎn)錄本呈階梯狀排列,分別檢測到6、5、4、3、2、1、0條轉(zhuǎn)錄本,與預(yù)期結(jié)果一致。
三、RT-PCR
RT-PCR結(jié)果表明,三組引物US12-R/US14-LF,US14-LR/US15-F與US15-R/US17-FRT-PCR產(chǎn)物長度與來自HCMV基因組為模板的PCR產(chǎn)物長度均完全一致,亦與預(yù)期大小相符,分別為1974bp,1700bp與2317bp。AMV反轉(zhuǎn)錄酶陰性對照組
13、未見任何擴增產(chǎn)物。HCMV Han感染HELF US12-US17基因區(qū)轉(zhuǎn)錄本中可以基本排除剪切轉(zhuǎn)錄的可能。
四、3' RACE及5' RACE
3' RACE測序結(jié)果表明,US12、US13、US14轉(zhuǎn)錄本3'末端定位于US12 ORF3'端下游20bp處的nt207055-207060處。
5'RACE測序結(jié)果表明,US12單順反子轉(zhuǎn)錄本主要起始于Han基因組中nt207948,1800nt轉(zhuǎn)錄本5'末
14、端定位于nt208810-208818,2100nt與2800nt轉(zhuǎn)錄本分別定位于nt209132-209156與nt209856-210024處,3600nt與4600nt轉(zhuǎn)錄本分別定位于nt210330-210654和nt211601-211641處,USt7轉(zhuǎn)錄本5'末端定位于nt212370-212650,分布離散,但主帶序列起始于nt212568。
AD169株US17轉(zhuǎn)錄本也作了5'RACE檢測。AD169株5'R
15、ACE末端定位nt208472,nt208356與nt208270分別對應(yīng)于Han株的nt212568,nt212449與nt212370,推測這三個起始位點更加可信,是US17轉(zhuǎn)錄本的主要起始位點。
RACE實驗證實,Han株US12-US17基因區(qū)轉(zhuǎn)錄本具有相同的3'末端和不同的5'末端。
五、Han-△US12-BAC克隆及毒株的構(gòu)建
經(jīng)PCR及測序驗證Han-△US12-BAC克隆構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染HE
16、LF成功包裝獲得感染性Han-△US12-BAC病毒。
六、Han-△US12-BAC毒生長曲線實驗
Han-△US12-BAC毒與Han-wt-BAC毒以MOI0.1 pfu/cell感染HELF,檢測感染后不同時間點(days post infection,dpi)培養(yǎng)基上清病毒樣本的滴度,生長曲線實驗表明,兩種毒株在HELF中復(fù)制增殖與擴散水平無明顯差異。
結(jié)論:
HCMV Han株及AD1
17、69株感染HELF,US12-US17基因區(qū)檢測到一簇晚期單向非剪切轉(zhuǎn)錄本,3'共末端,5'端轉(zhuǎn)錄起始位點不同,長度分別為889-894nt,1751-1764nt,2073-2102nt,2797-2970nt,3271-3600nt,4542-4587nt及5311-5596nt。
成功構(gòu)建Han-△US12-BAC克隆及毒株,Han-△US12-BAC毒與Han-wt-BAC毒在HELF中復(fù)制擴散水平無明顯差異,證實US
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