人巨細胞病毒US12-US17基因區(qū)轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的研究及US12編碼產(chǎn)物功能初探.pdf

1、目的：
　　為進一步對US12基因功能進行初步研究，利用Han-wt-BAC，構(gòu)建US12基因缺失BAC克隆，電轉(zhuǎn)人胚肺成纖維細胞(HELF)，病毒成功包裝獲得Han-△US12-BAC毒。Han-△US12-BAC毒與Han-wt-BAC毒按照MOI0.1蝕斑形成單位/細胞接毒感染HELF，不同時間點收病毒上清，進行病毒樣本滴度測定，繪制生長曲線，對兩株病毒在HELF中的復(fù)制水平進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Han US12缺失BAC株與

2、Han野毒BAC株在HELF中生長擴散并無明顯差異，提示US12是HCMV Han在HELF中復(fù)制與擴散中的非必需基因。
　　方法：
　　一、實驗材料
　　HCMV低傳代分離株Han為中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室分離并保存;細胞株HELF、HCMV實驗室株AD169由羅敏華教授惠贈;BAC體系相關(guān)實驗材料由朱樺博士惠贈;HCMV Han-wt-BAC為羅敏華教授課題組與我室共同構(gòu)建;HCMV Han-wt-BAC

3、病毒株已成功包裝并保存;HCMV Han株cDNA文庫為本室構(gòu)建并保存;引物合成及測序由Invitrogen公司完成;常用實驗設(shè)備包括Tanon凝膠成像分析系統(tǒng)、Beckman臺式低溫高速離心機、Bio-rad PCR循環(huán)儀、BioRad電轉(zhuǎn)儀、生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡等;所用生物信息學(xué)軟件主要包括序列比對軟件BLAST、引物設(shè)計軟件primer premier5.0、序列分析軟件包DNAstar等。
　　二、實驗方

4、法
　?。ㄒ唬ヽDNA文庫篩選
　　設(shè)計US12基因特異性文庫擴增引物，應(yīng)用菌液PCR依次從cDNA文庫三級、二級、一級模板和單克隆中篩選出含有US12 cDNA序列的陽性克隆并測序。
　?。ǘ㎞orthern blot
　　制備Han株與AD169株感染HELF后IE，E，L期及mock對照總RNA樣本。設(shè)計并合成US12-US17基因特異性RNA探針，應(yīng)用Northern印記雜交技術(shù)檢測Han與AD169株

5、US12-US17基因區(qū)在病毒感染不同時期的轉(zhuǎn)錄時序和轉(zhuǎn)錄本的長度。
　?。ㄈ㏑T-PCR
　　為鑒定US12-US17基因區(qū)是否存在內(nèi)含子，應(yīng)用US12-R/US14-LF，US14-LR/US15-F與US15-R/US17-F三對引物RT-PCR擴增Han株晚期RNA。將Han株RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別以Han cDNA及Han基因組為模板，PCR擴增，根據(jù)其產(chǎn)物片段大小比較，確認在US12-US17區(qū)是否存在剪

6、切轉(zhuǎn)錄形式。
　?。ㄋ模?' RACE和5'RACE
　　針對Northern blot檢測到的所有US12-US17基因區(qū)轉(zhuǎn)錄本，通過3'RACE及5'RACE獲得這些全長轉(zhuǎn)錄本的3'端和5'端序列及在Han株與AD169株基因組中的定位。
　　（五）US12缺失BAC克隆構(gòu)建
　　首先制備E.coli DY380-Han-wt-BAC電轉(zhuǎn)感受態(tài)。以pGEM-oriV/Kan質(zhì)粒為模板，PCR擴增卡那抗性基因，

7、DpnⅠ酶切并純化，電轉(zhuǎn)E.coli DY380-Han-wt-BAC感受態(tài)，卡那霉素LB平板篩選正確重組單克隆，PCR鑒定及測序驗證。經(jīng)驗證的單克隆擴增搖菌，提取Han-△US12-BAC質(zhì)粒。
　　（六）Han-△US12-BAC毒在HELF中包裝
　　Han-△US12-BAC質(zhì)粒電轉(zhuǎn)HELF，通過綠色熒光蛋白(green fluorescenceprotein，GFP)表達及細胞病變效應(yīng)（cytopathic eff

8、ect，CPE）出現(xiàn)，驗證是否正確包裝為感染性病毒。CPE達到100％后，傳代擴增毒株。
　　（七）Han-△US12-BAC毒及Han-wt-BAC毒生長曲線實驗
　　TCID50法測定Han-△US12-BAC毒及Han-wt-BAC毒滴度。按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為0.1 pfu/cell接毒于HELF，感染后0、2、4、6、8、10、12天分別收病毒上清液。收毒標本T

9、CID50法測滴度，繪制生長曲線。
　?。ò耍┥镄畔W(xué)分析
　　引物設(shè)計應(yīng)用Primer premier5.0，序列比對應(yīng)用BLAST，DNA序列分析及蛋白特性分析應(yīng)用BioEdit5.0.0與DNAStar5.1。
　　結(jié)果：
　　一、cDNA文庫篩選
　　從HCMV Han株晚期cDNA文庫中共篩選出23個含有US12特異序列的陽性cDNA克隆。一個克隆檢測到定位于Han株核苷酸位點(nucleoti

10、de,nt)208816-207055的1762bp轉(zhuǎn)錄本，是涵蓋US12、US13 ORF序列的雙順反子。其它22個陽性克隆為890bp cDNA序列，僅包含US12基因，為單順反子轉(zhuǎn)錄本。5'端定位于nt207945-207948，3'端定位于nt207055-207062。
　　二、Northern blot檢測
　　應(yīng)用US12-P在Han株感染HELF的L期RNA中共檢測到6條轉(zhuǎn)錄本，長度分別約為4600nt，36

11、00nt，2800nt，2100nt，1800nt及900nt，在AD169株L期RNA中除以上六條轉(zhuǎn)錄本外，另檢測到一條約5600nt的轉(zhuǎn)錄本。而在IE，E期RNA與mock對照組RNA中未鑒定到任何轉(zhuǎn)錄本。在這些轉(zhuǎn)錄本中，900nt轉(zhuǎn)錄本表達豐度最高，1800nt轉(zhuǎn)錄本次之。
　　應(yīng)用US12-US17基因區(qū)各個基因特異性探針US12-P，US13-P，US14-LP,US14-UP，US15-P，US16-P與US17-P檢

12、測Han株晚期RNA，不同探針鑒定到的轉(zhuǎn)錄本呈階梯狀排列，分別檢測到6、5、4、3、2、1、0條轉(zhuǎn)錄本，與預(yù)期結(jié)果一致。
　　三、RT-PCR
　　RT-PCR結(jié)果表明，三組引物US12-R/US14-LF，US14-LR/US15-F與US15-R/US17-FRT-PCR產(chǎn)物長度與來自HCMV基因組為模板的PCR產(chǎn)物長度均完全一致，亦與預(yù)期大小相符，分別為1974bp，1700bp與2317bp。AMV反轉(zhuǎn)錄酶陰性對照組

13、未見任何擴增產(chǎn)物。HCMV Han感染HELF US12-US17基因區(qū)轉(zhuǎn)錄本中可以基本排除剪切轉(zhuǎn)錄的可能。
　　四、3' RACE及5' RACE
　　3' RACE測序結(jié)果表明，US12、US13、US14轉(zhuǎn)錄本3'末端定位于US12 ORF3'端下游20bp處的nt207055-207060處。
　　5'RACE測序結(jié)果表明，US12單順反子轉(zhuǎn)錄本主要起始于Han基因組中nt207948，1800nt轉(zhuǎn)錄本5'末

14、端定位于nt208810-208818，2100nt與2800nt轉(zhuǎn)錄本分別定位于nt209132-209156與nt209856-210024處，3600nt與4600nt轉(zhuǎn)錄本分別定位于nt210330-210654和nt211601-211641處，USt7轉(zhuǎn)錄本5'末端定位于nt212370-212650，分布離散，但主帶序列起始于nt212568。
　　AD169株US17轉(zhuǎn)錄本也作了5'RACE檢測。AD169株5'R

15、ACE末端定位nt208472，nt208356與nt208270分別對應(yīng)于Han株的nt212568，nt212449與nt212370，推測這三個起始位點更加可信，是US17轉(zhuǎn)錄本的主要起始位點。
　　RACE實驗證實，Han株US12-US17基因區(qū)轉(zhuǎn)錄本具有相同的3'末端和不同的5'末端。
　　五、Han-△US12-BAC克隆及毒株的構(gòu)建
　　經(jīng)PCR及測序驗證Han-△US12-BAC克隆構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染HE

16、LF成功包裝獲得感染性Han-△US12-BAC病毒。
　　六、Han-△US12-BAC毒生長曲線實驗
　　Han-△US12-BAC毒與Han-wt-BAC毒以MOI0.1 pfu/cell感染HELF，檢測感染后不同時間點(days post infection，dpi)培養(yǎng)基上清病毒樣本的滴度，生長曲線實驗表明，兩種毒株在HELF中復(fù)制增殖與擴散水平無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　HCMV Han株及AD1

17、69株感染HELF，US12-US17基因區(qū)檢測到一簇晚期單向非剪切轉(zhuǎn)錄本，3'共末端，5'端轉(zhuǎn)錄起始位點不同，長度分別為889-894nt，1751-1764nt,2073-2102nt,2797-2970nt,3271-3600nt,4542-4587nt及5311-5596nt。
　　成功構(gòu)建Han-△US12-BAC克隆及毒株，Han-△US12-BAC毒與Han-wt-BAC毒在HELF中復(fù)制擴散水平無明顯差異，證實US