皮膚鱗癌光動(dòng)力DC疫苗預(yù)防小鼠皮膚鱗癌的療效及免疫機(jī)制研究.pdf

1、背景:皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）是人類頭面部和生殖器最常見、危害最大的皮膚惡性腫瘤之一，約占非黑素性皮膚腫瘤的20％。常規(guī)手術(shù)、激光、放療等可直接去除或破壞腫瘤組織，但這些方法存在組織結(jié)構(gòu)破壞性大、易復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)后再次治療困難等問題。由于SCC免疫原性弱，宿主免疫功能缺陷或低下無法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，是SCC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因。因此，增強(qiáng)腫瘤的免疫原性恢復(fù)

2、腫瘤抗原激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力成為治療腫瘤的有效免疫療法之一。光動(dòng)力治療（Photodynamic Therapy,PDT）是光敏劑聚集于增生旺盛的組織（如腫瘤組織等），用相應(yīng)波長的光源局部照射，激發(fā)光化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致病變組織破壞的治療方法。PDT不僅能直接殺傷腫瘤細(xì)胞、損傷腫瘤脈管系統(tǒng)，而且能產(chǎn)生較多的腫瘤抗原性物質(zhì)（如HSP70、高遷移率蛋白等）誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答。課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALA-PDT后的腫瘤組織局部DC、CD

3、4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞明顯增多，且有較多的炎癥細(xì)胞浸潤和TNF-α，IL-1β，IL-6等炎癥介質(zhì)表達(dá)上調(diào)。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，是連接適應(yīng)性免疫應(yīng)答和固有免疫應(yīng)答的橋梁，在免疫系統(tǒng)中有著不容忽視的作用。正常情況下，DC表現(xiàn)為未成熟狀態(tài)，攝取抗原及遷移能力較強(qiáng)，當(dāng)受到腫瘤抗原等刺激以后，DC被誘導(dǎo)成熟，遞呈抗原的能力顯著增強(qiáng)，將加工處理過的腫瘤抗原肽-復(fù)合物遞呈給T細(xì)胞，

4、從而啟動(dòng)宿主的抗腫瘤免疫應(yīng)答。研究表明，腫瘤抗原肽等體外沖擊DC，形成DC疫苗后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫。有報(bào)道稱腫瘤細(xì)胞裂解物與DC共培養(yǎng)制成的DC疫苗能特異性誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，從而對(duì)腫瘤產(chǎn)生治療作用并有效預(yù)防腫瘤的發(fā)生。
　　目的:研究ALA-PDT處理的PECA細(xì)胞裂解物誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的小鼠骨髓來源的DC成熟情況，并進(jìn)一步探討體外ALA-PDT處理的PECA細(xì)胞裂解物沖擊DC所制備的PDT-DC疫苗預(yù)防皮膚鱗癌的

5、療效及作用機(jī)制。
　　方法:(1)皮膚鱗癌ALA光動(dòng)力DC疫苗制備:原代培養(yǎng)SKH-1無毛小鼠骨髓來源DC，以0.5J/cm2的ALA-PDT處理PECA，將得到的細(xì)胞裂解物與DC共培養(yǎng)，倒置顯微鏡及透射電鏡觀察DC形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ;(2)皮膚鱗癌ALA光動(dòng)力DC疫苗預(yù)防皮膚鱗癌的療效觀察:取50只小鼠，分為5組，將PDT-DC疫苗、PDT-PECA瘤苗、F/T-DC疫苗及培養(yǎng)基分別免

6、疫小鼠三次后7天，在小鼠對(duì)側(cè)背部皮下注射活PECA細(xì)胞，觀察小鼠腫瘤生長情況，計(jì)算各組小鼠成瘤率，每天測(cè)量小鼠體積及體重，觀察皮膚鱗癌ALA光動(dòng)力DC疫苗預(yù)防皮膚鱗癌的作用;(3)皮膚鱗癌ALA光動(dòng)力DC疫苗預(yù)防皮膚鱗癌的機(jī)制研究:注射活PECA細(xì)胞7天后，HE及免疫組化檢測(cè)局部CD4+T、CD8+T及Treg細(xì)胞浸潤情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞中CD4+T、CD8+T及Treg細(xì)胞的比例，ELISA檢測(cè)小鼠外周血IFN-γ，IL-12及

7、IL-10的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)0.5J/cm2的ALA-PDT處理PECA所得的細(xì)胞裂解物能夠誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的DC形態(tài)成熟，同時(shí)使得DC表面的CD80、CD86及MHC-Ⅱ類分子表達(dá)上調(diào);(2)免疫小鼠三次，并在小鼠對(duì)側(cè)背部注射PECA細(xì)胞后，PDT-DC疫苗組小鼠未形成腫瘤，PDT-PECA瘤苗、F/T-DC疫苗及腫瘤對(duì)照組小鼠的成瘤率分別為50％、90％及100％，所形成的腫瘤體積及老鼠的質(zhì)量隨時(shí)間的延長而增加;(3)

8、免疫組化結(jié)果示:PDT-DC疫苗局部的CD4+T及CD8+T細(xì)胞均為陽性，而其余對(duì)照組為陰性，所有實(shí)驗(yàn)組的局部Treg細(xì)胞均未見明顯陽性;PDT-DC疫苗組脾細(xì)胞中CD4+T及CD8+T細(xì)胞比例高于其他對(duì)照組，Treg細(xì)胞比例低于其他對(duì)照組;外周血中IFN-γ及IL-12高于其他對(duì)照組，而IL-10則低于其他對(duì)照組。
　　結(jié)論:0.5J/cm2的ALA-PDT處理的PECA細(xì)胞裂解沖擊DC所制備的PDT-DC疫苗能預(yù)防皮膚鱗癌的發(fā)