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文檔簡介
1、目的:皮膚光老化是指皮膚長期受紫外線UVA和UVB輻射而引起的過早衰老的過程。臨床上,以皮膚紋理粗糙,干燥,皺紋增多,松弛,缺乏彈性,有不規(guī)則的色素沉著等為特征。光老化不僅使皮膚功能失調(diào),還與多種皮膚疾病甚至皮膚腫瘤密切相關(guān)。應(yīng)用防曬衣、防曬霜等減少皮膚日光照射量是從源頭上預(yù)防光老化最有效的方法,但亦有很多局限。通過國內(nèi)外文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),皮膚光老化的發(fā)生與紫外線(UV)誘導(dǎo)過度生成活性氧自由基(ROS)以及炎癥反應(yīng)等有關(guān),而抗炎和抗氧化是
2、防治皮膚光老化的方法之一。
家蠅幼蟲(Musca Demestica larvae),俗稱蛆,又名五谷蟲,干燥物系中藥羅仙子,其提取物具有抗菌、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等生物活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),羅仙子富含蛋白提取物還具有一定抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化以及抗衰老等作用。而皮膚光老化的發(fā)生與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān),提示羅仙子提取物可能具有干擾或預(yù)防皮膚光老化發(fā)生的作用。鑒于此,本文以羅仙子為原材料,探索一個合適、便捷的方法提取
3、其中具有抗氧化活性的蛋白或多肽成分,并觀察其對紫外線誘導(dǎo)的皮膚光老化小鼠模型的防護(hù)作用,從組織病理學(xué)、氧化應(yīng)激損傷機(jī)制、炎癥反應(yīng)等角度初步探討可能的保護(hù)機(jī)制。
方法:
1.羅仙子抗氧化肽的制備工藝研究①“提蛋白-酶解法”制備抗氧化肽:采用“堿溶酸沉法”提取羅仙子蛋白,而后用堿性蛋白酶Alcalase對其進(jìn)行水解,并以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo),通過單因素和正交試驗優(yōu)化酶解工藝條件;酶解液通過10kDa和5kDa的
4、超濾膜進(jìn)行分步分離,分離后各組分進(jìn)行蛋白或多肽濃度測定以及DPPH自由基清除活性測定,統(tǒng)計得率。②“水提醇沉法”制備抗氧化肽:測定水提醇沉后上清DPPH自由基清除活性,測定濃度并計算得率。③采用TSKgel G2000SW凝膠柱分析上清和沉淀的分子量分布,通過分子量分布、DPPH自由基清除活性和得率比較以選擇合適的抗氧化肽制備方法。④羅仙子抗氧化肽抗氧化活性評價:以強(qiáng)抗氧化劑維生素C(VC)作對照,測定羅仙子抗氧化肽DPPH自由基、羥自
5、由基、ABTS自由基的清除率,并與維生素C對各自由基的半數(shù)清除濃度(EC50)進(jìn)行比較,評價其抗氧化活性。
2.羅仙子抗氧化肽對UV誘導(dǎo)皮膚光老化模型保護(hù)作用研究實驗采用56只雌性Balb/c小鼠,將其隨機(jī)分為正常對照組(NC)、模型對照組(MC)、基質(zhì)對照組(OC)、羅仙子抗氧化肽低劑量組-2%(L)、中劑量組-4%(M)、高劑量組-8%(H)和維生素E組(VE)。每日給予小鼠背部剃毛處理,外涂給藥處理后1h進(jìn)行UVA和UV
6、B照射,每周照射6天,持續(xù)6周,UVA和UVB累積輻照劑量分別為91.2J/cm2和9.12J/cm2(模擬日光UVA與UVB的比例)。造模結(jié)束后觀察各組小鼠皮膚外觀并拍照記錄,測定各組小鼠背部皮膚厚度,評價羅仙子抗氧化肽對UV誘導(dǎo)小鼠皮膚光老化模型的保護(hù)作用。對小鼠皮膚組織進(jìn)行HE染色觀察、醛品紅染色觀察、透射電鏡觀察,測定小鼠皮膚組織中MDA含量,SOD、GSH-Px酶活力,金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-1和MMP-3含量,炎癥因子TNF-
7、α、IL-1β和IL-6含量,初步探討羅仙子抗氧化肽對小鼠皮膚光老化模型保護(hù)作用可能的機(jī)制。
結(jié)果:
1.羅仙子抗氧化肽的制備工藝研究①“提蛋白-酶解法”制備抗氧化肽:采用“堿溶酸沉法”提取羅仙子蛋白后,單因素試驗和正交試驗確定了羅仙子蛋白最佳酶解工藝條件為:加酶量7000U/g,底物質(zhì)量濃度1%,酶解反應(yīng)時間15min,酶解溫度50℃,pH值7.5。酶解液通過10kDa和5kDa超濾濾膜分步分離后,共收集到3個分子
8、段組分,分子量范圍分別為MW>10kDa、5kDa 9、。③兩種方法比較:“堿溶酸沉法”提取上清中含有一定比例的大分子量蛋白,而“水提醇沉法”提取上清中無,為分子量4kDa左右小肽,提取過程簡單,污染小,得率高,清除 DPPH自由基活性強(qiáng)。因此,“水提醇沉法”提取上清中小肽適合制備抗氧化肽。④羅仙子抗氧化肽抗氧化活性評價:羅仙子抗氧化肽對DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的半數(shù)清除濃度(EC50)分別為0.117、2.232、2.546mmol/L(以平均摩爾質(zhì)量和質(zhì)量濃度計算所得), 10、VC對各自由基的EC50與抗氧化肽的比值分別為:1∶6.5(DPPH·)、1∶3.97(ABTS·+)和0.84∶1(OH·)。VC是強(qiáng)抗氧化劑,與之對三種自由基的清除活性比較可以看出,羅仙子抗氧化肽亦具有較強(qiáng)的抗氧化活性。 11、脫皮減少。HE染色和醛品紅染色結(jié)果顯示,中、高劑量組對UV誘導(dǎo)的角質(zhì)層加厚,角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖,排列不規(guī)則,真皮乳頭消失,彈性纖維排列紊亂,斷裂、成團(tuán)等有一定的改善。與正常組相比,模型組MDA含量顯著上升,SOD和GSH-Px活力顯著降低,MMP-1和MMP-3含量顯著升高,炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高;而與模型組相比,羅仙子抗氧化肽中、高劑量組MDA含量顯著降低,SOD和GSH-Px活力顯著提升,MMP-1和 12、MMP-3含量顯著降低,TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著降低。
2.羅仙子抗氧化肽對UV誘導(dǎo)皮膚光老化模型保護(hù)作用研究與正常組相比,模型組小鼠皮膚厚度顯著增加,出現(xiàn)大量紅斑、脫皮現(xiàn)象,膚質(zhì)粗糙、變硬;與模型組相比,羅仙子抗氧化肽中、高劑量組小鼠皮膚厚度明顯降低,紅斑和
結(jié)論:本文采用“堿溶酸沉法”提取了羅仙子蛋白,并通過單因素和正交試驗確立了羅仙子蛋白最佳酶解工藝條件為:加酶量7000U/g,底物質(zhì)量濃度1%,酶解反應(yīng)時間15min,酶解溫度50℃,pH值7.5。采用10kDa和5kDa濾膜對酶解液進(jìn)行分步超濾,其中5kDa
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