羅仙子抗氧化肽的制備及對(duì)皮膚光老化預(yù)防作用研究.pdf

1、目的：皮膚光老化是指皮膚長(zhǎng)期受紫外線UVA和UVB輻射而引起的過(guò)早衰老的過(guò)程。臨床上，以皮膚紋理粗糙，干燥，皺紋增多，松弛，缺乏彈性，有不規(guī)則的色素沉著等為特征。光老化不僅使皮膚功能失調(diào)，還與多種皮膚疾病甚至皮膚腫瘤密切相關(guān)。應(yīng)用防曬衣、防曬霜等減少皮膚日光照射量是從源頭上預(yù)防光老化最有效的方法，但亦有很多局限。通過(guò)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，皮膚光老化的發(fā)生與紫外線（UV）誘導(dǎo)過(guò)度生成活性氧自由基（ROS）以及炎癥反應(yīng)等有關(guān)，而抗炎和抗氧化是

2、防治皮膚光老化的方法之一。
　　家蠅幼蟲（Musca Demestica larvae），俗稱蛆，又名五谷蟲，干燥物系中藥羅仙子，其提取物具有抗菌、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等生物活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，羅仙子富含蛋白提取物還具有一定抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及抗衰老等作用。而皮膚光老化的發(fā)生與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)，提示羅仙子提取物可能具有干擾或預(yù)防皮膚光老化發(fā)生的作用。鑒于此，本文以羅仙子為原材料，探索一個(gè)合適、便捷的方法提取

3、其中具有抗氧化活性的蛋白或多肽成分，并觀察其對(duì)紫外線誘導(dǎo)的皮膚光老化小鼠模型的防護(hù)作用，從組織病理學(xué)、氧化應(yīng)激損傷機(jī)制、炎癥反應(yīng)等角度初步探討可能的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　1.羅仙子抗氧化肽的制備工藝研究①“提蛋白-酶解法”制備抗氧化肽：采用“堿溶酸沉法”提取羅仙子蛋白，而后用堿性蛋白酶Alcalase對(duì)其進(jìn)行水解，并以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件；酶解液通過(guò)10kDa和5kDa的

4、超濾膜進(jìn)行分步分離，分離后各組分進(jìn)行蛋白或多肽濃度測(cè)定以及DPPH自由基清除活性測(cè)定，統(tǒng)計(jì)得率。②“水提醇沉法”制備抗氧化肽：測(cè)定水提醇沉后上清DPPH自由基清除活性，測(cè)定濃度并計(jì)算得率。③采用TSKgel G2000SW凝膠柱分析上清和沉淀的分子量分布，通過(guò)分子量分布、DPPH自由基清除活性和得率比較以選擇合適的抗氧化肽制備方法。④羅仙子抗氧化肽抗氧化活性評(píng)價(jià)：以強(qiáng)抗氧化劑維生素C（VC）作對(duì)照，測(cè)定羅仙子抗氧化肽DPPH自由基、羥自

5、由基、ABTS自由基的清除率，并與維生素C對(duì)各自由基的半數(shù)清除濃度（EC50）進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其抗氧化活性。
　　2.羅仙子抗氧化肽對(duì)UV誘導(dǎo)皮膚光老化模型保護(hù)作用研究實(shí)驗(yàn)采用56只雌性Balb/c小鼠，將其隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC）、模型對(duì)照組（MC）、基質(zhì)對(duì)照組（OC）、羅仙子抗氧化肽低劑量組-2％（L）、中劑量組-4%（M）、高劑量組-8%（H）和維生素E組（VE）。每日給予小鼠背部剃毛處理，外涂給藥處理后1h進(jìn)行UVA和UV

6、B照射，每周照射6天，持續(xù)6周，UVA和UVB累積輻照劑量分別為91.2J/cm2和9.12J/cm2（模擬日光UVA與UVB的比例）。造模結(jié)束后觀察各組小鼠皮膚外觀并拍照記錄，測(cè)定各組小鼠背部皮膚厚度，評(píng)價(jià)羅仙子抗氧化肽對(duì)UV誘導(dǎo)小鼠皮膚光老化模型的保護(hù)作用。對(duì)小鼠皮膚組織進(jìn)行HE染色觀察、醛品紅染色觀察、透射電鏡觀察，測(cè)定小鼠皮膚組織中MDA含量，SOD、GSH-Px酶活力，金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-1和MMP-3含量，炎癥因子TNF-

7、α、IL-1β和IL-6含量，初步探討羅仙子抗氧化肽對(duì)小鼠皮膚光老化模型保護(hù)作用可能的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.羅仙子抗氧化肽的制備工藝研究①“提蛋白-酶解法”制備抗氧化肽：采用“堿溶酸沉法”提取羅仙子蛋白后，單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了羅仙子蛋白最佳酶解工藝條件為：加酶量7000U/g，底物質(zhì)量濃度1%，酶解反應(yīng)時(shí)間15min，酶解溫度50℃，pH值7.5。酶解液通過(guò)10kDa和5kDa超濾濾膜分步分離后，共收集到3個(gè)分子

8、段組分，分子量范圍分別為MW>10kDa、5kDa

9、。③兩種方法比較：“堿溶酸沉法”提取上清中含有一定比例的大分子量蛋白，而“水提醇沉法”提取上清中無(wú)，為分子量4kDa左右小肽，提取過(guò)程簡(jiǎn)單，污染小，得率高，清除 DPPH自由基活性強(qiáng)。因此，“水提醇沉法”提取上清中小肽適合制備抗氧化肽。④羅仙子抗氧化肽抗氧化活性評(píng)價(jià)：羅仙子抗氧化肽對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的半數(shù)清除濃度（EC50）分別為0.117、2.232、2.546mmol/L（以平均摩爾質(zhì)量和質(zhì)量濃度計(jì)算所得），

10、VC對(duì)各自由基的EC50與抗氧化肽的比值分別為：1∶6.5（DPPH·）、1∶3.97（ABTS·+）和0.84∶1（OH·）。VC是強(qiáng)抗氧化劑，與之對(duì)三種自由基的清除活性比較可以看出，羅仙子抗氧化肽亦具有較強(qiáng)的抗氧化活性。
　　2.羅仙子抗氧化肽對(duì)UV誘導(dǎo)皮膚光老化模型保護(hù)作用研究與正常組相比，模型組小鼠皮膚厚度顯著增加，出現(xiàn)大量紅斑、脫皮現(xiàn)象，膚質(zhì)粗糙、變硬；與模型組相比，羅仙子抗氧化肽中、高劑量組小鼠皮膚厚度明顯降低，紅斑和

11、脫皮減少。HE染色和醛品紅染色結(jié)果顯示，中、高劑量組對(duì)UV誘導(dǎo)的角質(zhì)層加厚，角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖，排列不規(guī)則，真皮乳頭消失，彈性纖維排列紊亂，斷裂、成團(tuán)等有一定的改善。與正常組相比，模型組MDA含量顯著上升，SOD和GSH-Px活力顯著降低，MMP-1和MMP-3含量顯著升高，炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高；而與模型組相比，羅仙子抗氧化肽中、高劑量組MDA含量顯著降低，SOD和GSH-Px活力顯著提升，MMP-1和

12、MMP-3含量顯著降低，TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著降低。
　　結(jié)論：本文采用“堿溶酸沉法”提取了羅仙子蛋白，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確立了羅仙子蛋白最佳酶解工藝條件為：加酶量7000U/g，底物質(zhì)量濃度1%，酶解反應(yīng)時(shí)間15min，酶解溫度50℃，pH值7.5。采用10kDa和5kDa濾膜對(duì)酶解液進(jìn)行分步超濾，其中5kDa