Rac1-Rab23促進皮膚鱗癌侵襲的關(guān)鍵分子.pdf

1、皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）是一種起源于表皮、皮膚附屬器、以及復(fù)層扁平上皮角質(zhì)形成細胞的惡性腫瘤，發(fā)病占皮膚惡性腫瘤的16％，僅次于基底細胞癌，光線性角化病、鮑溫病及角化棘皮瘤均能導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞的惡性增殖。cSCC具有侵襲性，可發(fā)生早期轉(zhuǎn)移。因此，鱗狀細胞癌的高轉(zhuǎn)移、易侵襲性是威脅全球人民的公共健康問題，進一步研究皮膚鱗癌侵襲機制，轉(zhuǎn)移以及增值的分子機制，具有重要的價值

2、和深遠的意義。
　　Rab23是小GTP酶Rab超家族成員，具有明顯的細胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Rab23在鱗癌中高表達，且與鱗癌分化負相關(guān)；Transwell實驗證實Rab23顯著促進鱗癌細胞侵襲，并調(diào)控侵襲關(guān)鍵分子Rac1的表達。但Rab23促進鱗癌細胞侵襲的機制尚不清楚。本研究擬以皮膚鱗狀細胞癌為研究對象，從臨床標本、細胞水平和動物實驗三方面，分別觀察Rab23與Rac1在鱗癌中表達的相關(guān)性，明確Rac1在R

3、ab23促進鱗癌侵襲中的關(guān)鍵作用，探討Rab23調(diào)控Rac1的作用機制，確認Rac1受Rab23調(diào)控后促進鱗癌侵襲的效應(yīng)分子，為全面闡明Rab23促進鱗癌侵襲作用的分子機制奠定基礎(chǔ)。
　　實驗方法：
　　一、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的建立及鑒定
　　慢病毒感染建立穩(wěn)定表達不同形式Rab23的Sa3鱗癌細胞株；Western blotting檢測Rab23、Rac1在穩(wěn)定表達不同形式Rab23的Sa3鱗癌細胞株中的表達。
　　二

4、、Rab23促進鱗癌侵襲，并依賴其GTP酶活性
　　1.細胞實驗：
　　Transwell侵襲實驗-檢測表達不同形式Rab23的皮膚鱗癌細胞侵襲力的不同及影響；
　　劃痕實驗-檢測表達不同形式Rab23的鱗癌細胞遷移力的不同及影響；
　　2.動物實驗：裸鼠荷瘤實驗在體觀察Rab23是否促進鱗癌細胞侵襲。
　　三、Rac1在Rab23促鱗癌侵襲中起關(guān)鍵作用
　　1.免疫組化檢測Rab23、Rac1在皮膚

5、鱗狀細胞癌及正常皮膚中的表達，統(tǒng)計分析Rab23、Rac1的陽性表達，分析二者相關(guān)性；
　　2.激光共聚焦檢測Rab23與Rac1在鱗癌細胞中的表達；
　　3.干涉Rac1之后檢測表達不同形式Rab23的鱗癌細胞株侵襲力及遷移力的變化；
　　4.激光共聚焦檢測Rab23與整合素α5β1的關(guān)系；干涉α亞單位后檢測表達不同形式Rab23的鱗癌細胞株侵襲力及遷移力的變化。
　　實驗結(jié)果：
　　1.Rab23在表達

6、不同形式 Rab23的鱗癌細胞中的表達：Sa3-Rab23-wt、Sa3-Rab23-Q68L中高表達，在Sa3-Rab23-S23N、Sa3-Rab23-RNAi中低表達，說明Sa3-Rab23不同表達細胞株建系成功；Rac1在表達不同形式Rab23的鱗癌細胞中的表達：Sa3-Rab23-wt、Sa3-Rab23-Q68L中高表達，在Sa3-Rab23-S23N、Sa3-Rab23-RNAi中低表達。
　　2.Transwell

7、實驗檢測Rab23對Sa3鱗癌細胞侵襲力的影響：細胞侵襲能力為Sa3-Rab23-Q68L＞Sa3-Rab23-wt＞Sa3-Rab23-S23N＞Sa3-Rab23-RNAi.
　　3.細胞劃痕實驗檢測Rab23對Sa3鱗癌細胞遷移能力的影響：細胞遷移能力為Sa3-Rab23-Q68L＞Sa3-Rab23-wt＞Sa3-Rab23-S23N＞Sa3-Rab23-RNAi.
　　4.裸鼠荷瘤實驗結(jié)果示：Sa3-Rab23-Q

8、68L組小鼠皮下注射1周后注射部位皮下形成直徑約0.6cm3大小結(jié)節(jié)，Sa3-Rab23-S23N、Sa3-Rab23-RNAi各組未成瘤。
　　5.Rab23、Rac1在皮膚鱗狀細胞癌中陽性表達，且在中低分化鱗癌中陽性表達程度較高；Rab23、Rac1在正常皮膚中不表達；Rab23與Rac1的表達正相關(guān)。
　　6.激光共聚焦觀察結(jié)果顯示：Sa3-Rab23-wt、Sa3-Rab23-Q68L細胞株Rab23在包膜上高表達，

9、且Rac1、α5β1整合素在包膜處與Rab23共定位。
　　7.不同方式干涉Rac1后Tra ns we ll、細胞劃痕實驗檢測Sa3鱗癌細胞侵襲能力、遷移能力的影響：Sa3細胞系行Rac1-inhib itor后，各株細胞侵襲能力、遷移能力均明顯下降；Sac3細胞系行干涉Rac1表達后，細胞侵襲能力、遷移能力與對照組相比均下降。
　　8.干涉α5β1整合素的α亞單位后Transwe ll、細胞劃痕實驗檢測Sa3鱗癌細胞侵襲

10、能力的影響：Sa3細胞系行α5β1整合素的α亞單位敲除后，細胞侵襲能力與對照組相比均下降。
　　主要結(jié)論：
　　1.Rab23、Rac1在皮膚鱗癌中高表達，且Rab23與Rac1的表達正相關(guān)，說明Rab23可能在皮膚鱗癌中正調(diào)控Rac1的表達。
　　2.Rab23高表達可以促進Sa3鱗癌細胞的侵襲和遷移，并且其可能是通過調(diào)控Rac1促進侵襲和轉(zhuǎn)移的。
　　3.Rab23調(diào)控Rac1是可能是通過調(diào)控α5β1整合素完