Rac1-Rab23促進(jìn)皮膚鱗癌侵襲的關(guān)鍵分子.pdf

1、皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）是一種起源于表皮、皮膚附屬器、以及復(fù)層扁平上皮角質(zhì)形成細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)病占皮膚惡性腫瘤的16％，僅次于基底細(xì)胞癌，光線性角化病、鮑溫病及角化棘皮瘤均能導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的惡性增殖。cSCC具有侵襲性，可發(fā)生早期轉(zhuǎn)移。因此，鱗狀細(xì)胞癌的高轉(zhuǎn)移、易侵襲性是威脅全球人民的公共健康問題，進(jìn)一步研究皮膚鱗癌侵襲機(jī)制，轉(zhuǎn)移以及增值的分子機(jī)制，具有重要的價值

2、和深遠(yuǎn)的意義。
　　Rab23是小GTP酶Rab超家族成員，具有明顯的細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Rab23在鱗癌中高表達(dá)，且與鱗癌分化負(fù)相關(guān)；Transwell實驗證實Rab23顯著促進(jìn)鱗癌細(xì)胞侵襲，并調(diào)控侵襲關(guān)鍵分子Rac1的表達(dá)。但Rab23促進(jìn)鱗癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制尚不清楚。本研究擬以皮膚鱗狀細(xì)胞癌為研究對象，從臨床標(biāo)本、細(xì)胞水平和動物實驗三方面，分別觀察Rab23與Rac1在鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性，明確Rac1在R

3、ab23促進(jìn)鱗癌侵襲中的關(guān)鍵作用，探討Rab23調(diào)控Rac1的作用機(jī)制，確認(rèn)Rac1受Rab23調(diào)控后促進(jìn)鱗癌侵襲的效應(yīng)分子，為全面闡明Rab23促進(jìn)鱗癌侵襲作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　實驗方法：
　　一、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立及鑒定
　　慢病毒感染建立穩(wěn)定表達(dá)不同形式Rab23的Sa3鱗癌細(xì)胞株；Western blotting檢測Rab23、Rac1在穩(wěn)定表達(dá)不同形式Rab23的Sa3鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　二

4、、Rab23促進(jìn)鱗癌侵襲，并依賴其GTP酶活性
　　1.細(xì)胞實驗：
　　Transwell侵襲實驗-檢測表達(dá)不同形式Rab23的皮膚鱗癌細(xì)胞侵襲力的不同及影響；
　　劃痕實驗-檢測表達(dá)不同形式Rab23的鱗癌細(xì)胞遷移力的不同及影響；
　　2.動物實驗：裸鼠荷瘤實驗在體觀察Rab23是否促進(jìn)鱗癌細(xì)胞侵襲。
　　三、Rac1在Rab23促鱗癌侵襲中起關(guān)鍵作用
　　1.免疫組化檢測Rab23、Rac1在皮膚

5、鱗狀細(xì)胞癌及正常皮膚中的表達(dá)，統(tǒng)計分析Rab23、Rac1的陽性表達(dá)，分析二者相關(guān)性；
　　2.激光共聚焦檢測Rab23與Rac1在鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)；
　　3.干涉Rac1之后檢測表達(dá)不同形式Rab23的鱗癌細(xì)胞株侵襲力及遷移力的變化；
　　4.激光共聚焦檢測Rab23與整合素α5β1的關(guān)系；干涉α亞單位后檢測表達(dá)不同形式Rab23的鱗癌細(xì)胞株侵襲力及遷移力的變化。
　　實驗結(jié)果：
　　1.Rab23在表達(dá)

6、不同形式 Rab23的鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)：Sa3-Rab23-wt、Sa3-Rab23-Q68L中高表達(dá)，在Sa3-Rab23-S23N、Sa3-Rab23-RNAi中低表達(dá)，說明Sa3-Rab23不同表達(dá)細(xì)胞株建系成功；Rac1在表達(dá)不同形式Rab23的鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)：Sa3-Rab23-wt、Sa3-Rab23-Q68L中高表達(dá)，在Sa3-Rab23-S23N、Sa3-Rab23-RNAi中低表達(dá)。
　　2.Transwell

7、實驗檢測Rab23對Sa3鱗癌細(xì)胞侵襲力的影響：細(xì)胞侵襲能力為Sa3-Rab23-Q68L＞Sa3-Rab23-wt＞Sa3-Rab23-S23N＞Sa3-Rab23-RNAi.
　　3.細(xì)胞劃痕實驗檢測Rab23對Sa3鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響：細(xì)胞遷移能力為Sa3-Rab23-Q68L＞Sa3-Rab23-wt＞Sa3-Rab23-S23N＞Sa3-Rab23-RNAi.
　　4.裸鼠荷瘤實驗結(jié)果示：Sa3-Rab23-Q

8、68L組小鼠皮下注射1周后注射部位皮下形成直徑約0.6cm3大小結(jié)節(jié)，Sa3-Rab23-S23N、Sa3-Rab23-RNAi各組未成瘤。
　　5.Rab23、Rac1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中陽性表達(dá)，且在中低分化鱗癌中陽性表達(dá)程度較高；Rab23、Rac1在正常皮膚中不表達(dá)；Rab23與Rac1的表達(dá)正相關(guān)。
　　6.激光共聚焦觀察結(jié)果顯示：Sa3-Rab23-wt、Sa3-Rab23-Q68L細(xì)胞株Rab23在包膜上高表達(dá)，

9、且Rac1、α5β1整合素在包膜處與Rab23共定位。
　　7.不同方式干涉Rac1后Tra ns we ll、細(xì)胞劃痕實驗檢測Sa3鱗癌細(xì)胞侵襲能力、遷移能力的影響：Sa3細(xì)胞系行Rac1-inhib itor后，各株細(xì)胞侵襲能力、遷移能力均明顯下降；Sac3細(xì)胞系行干涉Rac1表達(dá)后，細(xì)胞侵襲能力、遷移能力與對照組相比均下降。
　　8.干涉α5β1整合素的α亞單位后Transwe ll、細(xì)胞劃痕實驗檢測Sa3鱗癌細(xì)胞侵襲

10、能力的影響：Sa3細(xì)胞系行α5β1整合素的α亞單位敲除后，細(xì)胞侵襲能力與對照組相比均下降。
　　主要結(jié)論：
　　1.Rab23、Rac1在皮膚鱗癌中高表達(dá)，且Rab23與Rac1的表達(dá)正相關(guān)，說明Rab23可能在皮膚鱗癌中正調(diào)控Rac1的表達(dá)。
　　2.Rab23高表達(dá)可以促進(jìn)Sa3鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移，并且其可能是通過調(diào)控Rac1促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移的。
　　3.Rab23調(diào)控Rac1是可能是通過調(diào)控α5β1整合素完