LPS與富含色氨酸抗菌肽的相互作用及其對抗菌活性的影響.pdf

1、革蘭氏陰性菌所引發(fā)的敗血性休克已對人類健康造成了極大的威脅，其細胞壁主要成分脂多糖(LPS)是誘發(fā)敗血性休克的主要原因。本文研究了LPS對陽離子抗菌肽的抗菌活性的影響，以及LPS與抗菌肽之間的相互作用。
　　抗菌肽L-K6是從中國林蛙（Rana chensinensis）皮膚分泌物分離純化而來的天然抗菌肽temporin-1CEb的衍生肽，實驗室前期對L-K6進行了改造，通過對位置1、4、5、11和12的亮氨酸和異亮氨酸進行色氨酸

2、（Trp）替換，合成了7種含有Trp的新型改造肽，這7種抗菌肽都含有6個凈正電荷，對大腸桿菌等2種革蘭氏陰性菌有較好的抗菌活性，對肺炎克雷伯菌等3種菌活性較差。本論文首先研究了LPS對7種含Trp抗菌肽的抗菌活性的影響，結果表明:LPS不同程度地抑制7種抗菌肽的抗菌活性，并且隨LPS的濃度的增大，抗菌活性越小，尤其是L11W、L12W的抗菌活性受LPS的影響最大。這種影響與LPS抑制7種含Trp抗菌肽的膜作用活性有直接關系。膜去極化實驗

3、結果顯示抗菌肽對大腸桿菌原生質體的細胞膜去極化作用很強，與沒有LPS外膜的革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的去極化作用效果相似，但對完整的大腸桿菌的作用明顯降低。LPS對7種抗菌肽的膜去極化作用效果不同，對L12W的影響最大，L12W對去掉LPS細胞外膜的大腸桿菌原生質體去極化作用最強，對其它肽的影響不大，I1WL5W的去極化作用不受LPS的影響。模擬細菌外膜的脂質體鈣黃綠素的釋放的實驗結果也進一步證明了LPS降低了7種含有Trp的抗菌肽對膜

4、通透性的作用，結果與去極化效果相似。通過激光共聚焦的觀察發(fā)現(xiàn)，7種含有Trp的抗菌肽能夠破壞大腸桿菌細胞膜，進入細胞而殺死細菌，這是因為Trp殘基有高程度的疏水性，容易插入細菌膜內(nèi)。
　　7種含有Trp抗菌肽均帶有正電荷，是陽離子抗菌肽，而LPS帶有負電荷，本論文研究了這些抗菌肽與LPS之間的相互作用。采用CD光譜實驗，等溫滴定量熱法(ITC)，Zeta電勢，動態(tài)光散射(DLS)和FITC-LPS的解聚實驗，探討了7種含有Trp抗

5、菌肽通過靜電作用與LPS結合，滲透細菌外膜，最終破壞細胞質膜的作用機制。CD光譜顯示，7種抗菌肽在SP緩沖溶液中均呈無規(guī)則卷曲結構，但在LPS溶液中，四種抗菌肽的二級結構呈現(xiàn)規(guī)則的α-螺旋結構，說明LPS可以誘導抗菌肽形成規(guī)則結構。ITC實驗通過對熱力學參數(shù)的分析顯示37℃下抗菌肽與LPS的結合是一個放熱的過程，表明抗菌肽的正電荷可以通過靜電作用與LPS的負電荷結合。Zeta電勢實驗顯示LPS與7種抗菌肽發(fā)生電荷補償現(xiàn)象，也說明抗菌肽能

6、與LPS相互結合。DLS和FITC-LPS解聚實驗顯示抗菌肽與LPS結合后，能解聚LPS聚集體，使聚合狀態(tài)的LPS分子粒徑變小，有利于抗菌肽的滲入。7種抗菌肽的結合LPS及解聚LPS的效果不同，I1WL5W解聚效果最好，完全消除了大分子的LPS聚集體。
　　總之，7種含有Trp的抗菌肽的抗菌活性不同程度的受LPS的影響，細菌外膜中的LPS是抗菌肽的第一個滲透屏障，隨著肽與LPS的相互作用，部分抗菌肽得以穿透外膜到達內(nèi)膜，發(fā)揮殺菌作