產(chǎn)抗菌肽乳酸菌篩選與抗菌肽異源表達(dá).pdf

1、抗菌肽由于其抑菌譜廣、抑菌作用明顯、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)而逐漸成為一種能夠代替抗生素的極具市場(chǎng)前景的抗菌藥物。乳酸菌分泌的抗菌肽，具有無毒、無殘留、穩(wěn)定性好、高效等優(yōu)點(diǎn)，為天然食品防腐劑，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。但是由于乳酸菌抗菌肽產(chǎn)量相對(duì)較低，成本較高，未能廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品（馬奶酸奶粉和干酪）中分離乳酸菌，旨在從中篩選產(chǎn)抗菌肽的優(yōu)良菌株，并采用基因工程手段，在大腸桿菌中異源表達(dá)，為大量獲得乳酸菌抗菌肽提供途徑。

2、
　　本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品（馬奶酸奶粉、干酪）中分離獲得了79株乳酸菌。以單核李斯特菌為指示菌，從中篩選出8株抑菌效果較好的菌株。采用生理生化鑒定和16S rRNA菌種鑒定，確定其中6株為植物乳桿菌，其余兩株為屎腸球菌。采用雙層牛津杯法確定上述8株菌株效價(jià)，確定了最優(yōu)菌株1-4和2-2，以其作為實(shí)驗(yàn)材料，優(yōu)化乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的條件。結(jié)果顯示，抗菌肽合成的最佳條件為：培養(yǎng)時(shí)間12 h-16 h，培養(yǎng)溫度37℃，發(fā)酵液原始pH值6-7

3、，菌齡14 h，接種量108 CFU/mL。此條件下，乳酸菌菌體濃度最大，抗菌肽產(chǎn)量最高。根據(jù)抗菌肽Plantaricin E、Plantaricin F核苷酸序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增片段，與pCold-SUMO連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終確定宿主菌為ArcticExpress E. coli，誘導(dǎo)時(shí)間8 h，誘導(dǎo)溫度15℃，IPTG濃度0.2 mM。超聲破碎驗(yàn)證目標(biāo)蛋白在上清液中表達(dá)，無包涵體產(chǎn)生，采用非變性條

4、件純化。與Ni-NTA樹脂結(jié)合后發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)蛋白與雜蛋白完全分開，且濃度較大。pCold-SUMO-plnE表達(dá)的融合蛋白成功切割組氨酸標(biāo)簽，pCold-SUMO-plnF表達(dá)的融合蛋白則未切開。抑菌實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與植物乳桿菌菌液對(duì)比，兩種融合蛋白菌體破碎上清液抑菌效果不明顯，融合蛋白純化后有抑菌圈出現(xiàn)，且酶切his-SUMO-tag標(biāo)簽前后抑菌活性無明顯變化。研究表明，抗菌肽Plantaricin E、plantaricin F基因在大