雜合抗菌肽HMCM的原核表達及其抗菌活性的初步鑒定.pdf

1、抗菌肽是一類帶正電荷的兩親性小分子肽的總稱，具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點?？咕膩碓磸V泛，分類多樣，且生物活性很強，在醫(yī)藥、畜牧業(yè)以及食品等領域應用廣泛。
　　雜合抗菌肽是基因工程技術產(chǎn)物之一，利用基因工程技術生產(chǎn)抗菌肽具有用時短、含量高等優(yōu)點。雜合抗菌肽主要是由兩種或多種抗菌肽的部分功能肽鏈拼接組成，具有廣譜、低毒以及高效等優(yōu)點。研究發(fā)現(xiàn)，改造的抗菌肽具有與藍本相似甚至更強的生物活性，并且毒副作用降低，具有非常大的研究價值

2、。
　　本研究擬將哺乳動物抗菌肽（Hexapeptide）、兩棲類抗菌肽（Magainin）、昆蟲抗菌肽（CecropinA和Melittin）的有效作用部分拼接在一起，以獲得一種新型的雜合抗菌肽HMCM。本研究根據(jù)目的抗菌肽HMCM的氨基酸序列和大腸桿菌B細胞的密碼子偏好性設計了目的蛋白HMCM的基因序列，并對HMCM的生物信息學進行分析；設計了三條引物通過兩輪PCR反應獲得目的基因，將目的基因克隆到原核表達載體pET-32a-

3、c(+)構建了重組表達載體pET-32a-HMCM；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達細胞E.coliBL21(DE3)實現(xiàn)融合表達，通過摸索誘導時間、IPTG濃度、OD600和溫度等條件確定了融合蛋白表達的最佳條件，并確定了融合蛋白以可溶形式存在；通過親和層析快速純化了融合蛋白，并進行了Western-blotting鑒定；最后用EK酶酶切融合蛋白釋放出HMCM，對HMCM的抗菌性進行了初步分析。
　　本研究獲得的主要成果如下：
　　

4、①生物信息學分析表明，HMCM具有抗菌肽的基本性質(zhì)：分子量大小為4.07kD，等電點pI為12.805；N端親水，C端疏水；二級結(jié)構主要為α螺旋結(jié)構，含有少量的β折疊結(jié)構、β轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲。
　?、诮?jīng)兩輪PCR反應獲得了編碼HMCM的基因片段，并克隆到經(jīng)KpnI和EcoRI酶切的原核表達載體pET-32a-c(+)，獲得了重組表達載體pET-32a-HMCM。
　?、蹖崿F(xiàn)了融合蛋白在表達菌株E.coliBL21(DE3)

5、中的試表達以及表達條件的優(yōu)化。最終優(yōu)化的表達條件為：誘導時間3h，誘導初始OD600=0.9左右，誘導IPTG濃度為0.8mmol/L，誘導溫度為30℃。
　?、艹暡ㄆ扑閷嶒灡砻?，融合蛋白以可溶形式存在于菌體上清中。超濾濃縮上清液，親和層析純化后獲得了單一的目的條帶，并進行了Western-blotting鑒定。
　?、莸鞍诐舛葴y定結(jié)果表明，融合蛋白的表達水平達到了毫克級，每升培養(yǎng)液可生產(chǎn)11.92mg融合蛋白。