STAT1基因敲除小鼠模型在EV71感染研究中的應(yīng)用及土撥鼠肝炎病毒持續(xù)性感染模型的建立與應(yīng)用.pdf

1、本文主要從以下幾方面展開(kāi)論述：
　　第一部分 STAT1基因敲除小鼠模型在EV71感染研究中的應(yīng)用。
　　目的：研究STAT1基因敲除小鼠對(duì)EV71的敏感性，對(duì)EV71動(dòng)物模型的優(yōu)化提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　方法：利用LPS刺激STAT1基因敲除C57BL/6小鼠對(duì)模型免疫反應(yīng)穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，并利用微珠免疫分析(CBA)方法對(duì)血清免疫相關(guān)因子定量分析;利用EV71感染10日齡STAT1基因敲除小鼠后，觀察感染癥狀及病理表現(xiàn)，

2、利用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)對(duì)肌肉病毒RNA定量分析。利用相同劑量、相同毒株的EV71感染10日齡ICR小鼠，與STAT1基因敲除小鼠感染結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。
　　結(jié)果：LPS刺激后，STAT1基因敲除小鼠血清IL-1α、 IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、MIP-1α分泌水平下降，與野生型小鼠相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);EV71感染后，STAT1基因敲除小鼠病理?yè)p傷加重，骨骼肌中EV71抗原水平升高;STAT1

3、基因敲除小鼠骨骼肌中病毒載量升高(P＜0.05);與野生型C57BL/6小鼠及ICR小鼠相比，STAT1基因敲除小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的癥狀與更高的死亡率。
　　結(jié)論：STAT1在抗EV71感染的免疫過(guò)程中扮演重要角色，STAT1基因敲除可以提高小鼠對(duì)EV71病毒的敏感性。
　　第二部分 土撥鼠肝炎病毒持續(xù)性感染模型的建立與應(yīng)用。
　　目的：建立土撥鼠肝炎病毒（Woodchuck Hepatitis B virus，WHV）

4、感染3日齡土撥鼠的持續(xù)性感染動(dòng)物模型，利用模型對(duì)靈芝孢子粉藥物治療肝炎及免疫功能調(diào)節(jié)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，為慢性肝炎的機(jī)制性研究以及抗肝炎病毒藥物評(píng)價(jià)建立動(dòng)物模型基礎(chǔ)。
　　方法：核酸檢測(cè):根據(jù)土撥鼠肝炎病毒表面抗原(WHsAg)設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法，以WHV DNA全基因組質(zhì)粒梯度稀釋作為模板檢測(cè)引物擴(kuò)增靈敏度，以混合健康土撥鼠血清的WHV病毒為模板檢測(cè)引物的特異性，并從中篩選靈敏度高、無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶及引物二聚體的引物;利用Re

5、al-time PCR方法，WHV DNA全基因組質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)土撥鼠血清WHV進(jìn)行核酸定量檢測(cè)。表面抗原與核心抗體檢測(cè):利用本實(shí)驗(yàn)室免疫兔和蛋雞制備并純化的多克隆抗體，進(jìn)行土撥鼠血清中表面抗原WHsAg與核心抗體WHcAb檢測(cè)。細(xì)胞因子mRNA檢測(cè):Trizol法提取土撥鼠肝臟mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后使用Real-time PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：核酸檢測(cè):引物WHV N3 F與WHV N3 R，PCR

6、檢測(cè)靈敏度可達(dá)1×104copies/mL，且電泳未見(jiàn)明顯非特異性條帶及引物二聚體;WHV DNA全基因組質(zhì)粒的熔點(diǎn)曲線峰值一致，Tm均值為82.18℃，病毒拷貝數(shù)與Real-time PCR Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值為0.992。土撥鼠血清病毒載量水平在感染后3個(gè)月開(kāi)始高于檢測(cè)下限，感染后4-5個(gè)月達(dá)到血清病毒載量高峰后有所降低，維持在104copies/mL左右，并持續(xù)至感染8個(gè)月。雌性土撥鼠血清WHV病毒載量高值水平及高載量持續(xù)時(shí)間

7、高于雄性土撥鼠。給予靈芝孢子粉藥物后土撥鼠血清AST檢測(cè)數(shù)值降低。與給藥組相比，對(duì)照組IL-4、IL-8、PD-L1、NKp46的mRNA含量有所增高。給藥組CD8的mRNA含量高于對(duì)照組。對(duì)給藥組與對(duì)照組土撥鼠病理檢測(cè)結(jié)果顯示給藥組土撥鼠肝臟炎癥減輕。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)利用3日齡土撥鼠感染土撥鼠肝炎病毒，建立了土撥鼠肝炎病毒持續(xù)性感染動(dòng)物模型。對(duì)土撥鼠肝炎病毒持續(xù)性感染動(dòng)物模型的病毒載量、血清學(xué)指標(biāo)、肝功能酶指標(biāo)及病理進(jìn)行了分析