弓形蟲慢性感染模型和檢測方法的建立及初步應用.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性細胞內(nèi)寄生的單細胞原蟲，能感染幾乎所有的恒溫動物（包括人類），引起人獸共患的弓形蟲病。弓形蟲呈世界性分布，估計全世界成年人中至少有1/3的人感染，歐洲一些發(fā)達國家感染率高達80％以上。弓形蟲作為一種機會性致病原蟲，在免疫功能正常的宿主體內(nèi)通常形成包囊，造成隱性感染；而當機體免疫功能下降或受抑制（如惡性腫瘤患者、器官移植者及AIDS患者等）時，處于隱性感染狀態(tài)的蟲體就會活化，迅速增

2、生繁殖，破壞宿主細胞而引起多器官的損害，嚴重者可導致宿主死亡。婦女在妊娠早期感染弓形蟲可引起流產(chǎn)、畸胎、死胎，或引起胎兒先天性弓形蟲病，表現(xiàn)為智力低下、視網(wǎng)膜脈絡膜炎、癲癇等，這些癥狀可在胎兒出生時或是成長過程中出現(xiàn)。因此，弓形蟲病的診斷和疫苗研制對于保護易感人群以及促進人類優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。 弓形蟲感染的特點是機會性致病，其生物學基礎是速殖子和緩殖子的相互轉換，目前對弓形蟲病的治療仍以藥物為主，對速殖子的殺滅作用較明顯，對

3、包囊內(nèi)的緩殖子幾乎沒有作用。因此，建立一個穩(wěn)定、持續(xù)的弓形蟲慢性感染動物模型對進一步研究弓形蟲速殖子與緩殖子轉換機制、藥物篩選、弓形蟲病的診斷及疫苗等研究具有重要的意義。目前對于弓形蟲不同期特異性抗原分子的差異性表達的研究國內(nèi)外均有報道，許多弓形蟲基因已從速殖子中克隆、鑒定，其中大多數(shù)基因編碼的蛋白為速殖子與緩殖子共有，只有少數(shù)幾個被證實為速殖子期特有的，近年來，由于速殖子與緩殖子相互轉換機制引起研究者重視，一些緩殖子及包囊特有蛋白的編

4、碼基因也陸續(xù)被克隆、鑒定。 本研究用弓形蟲Prugniaud弱毒株感染小鼠構建弓形蟲慢性感染模型。同時對緩殖子期特異性抗原BAG1（Bradyzoite antigen 1）進行基因克隆、蛋白表達以及對重組抗原的免疫反應性進行分析；純化表達蛋白以獲得大量高純度的重組蛋白，用于弓形蟲慢性感染小鼠模型和人弓形蟲感染的檢測，為進一步診斷和疫苗的研究打下基礎。 目的： 1．克隆與表達弓形蟲緩殖子期特異性BAG1基因，純化

5、表達的蛋白，并分析重組抗原的免疫反應性。 2．構建弓形蟲慢性感染小鼠模型。 3．探討重組BAG1抗原在弓形蟲慢性感染小鼠中的檢測效能。 4．重組BAG1抗原在檢測人血清中的初步應用。 方法： 1．從緩殖子總RNA逆轉錄的cDNA擴增出BAG1基因片段，利用限制性內(nèi)切酶和連接酶克隆到經(jīng)過同樣酶切的pET-28a（+）表達載體中，構建表達型重組質粒。pET-28a（+）-BAG1，并對重組質粒進行酶切

6、及測序鑒定。 2．將重組質粒pET-28a（+）-BAG1轉入BL21（DE3）中，用IPTG誘導表達，優(yōu)化工程菌pET-28a（+）-BAG1的表達條件，大量誘導表達后對重組蛋白進行純化。 3．Western blotting與ELISA分析重組表達蛋白的免疫反應性。 4．采用經(jīng)口感染的方式，用弓形蟲Prugniaud株包囊感染昆明小鼠，分別在感染0d、2w、1mon、2mon、3mon、4mon、5mon、6

7、mon和9mon各時期采血分離血清。 5．重組BAG1抗原檢測弓形蟲慢性感染小鼠不同時期血清的IgG和IgM抗體，用重組SAG1和弓形蟲速殖子全蟲抗原（Toxo-Ag）做平行檢測。 6．重組BAG1抗原檢測特殊人群血清IgG和IgM抗體，用rSAG1和Toxo-Ag做平行檢測。 結果： 1．成功構建克隆重組質粒pET-28a（+）-BAG1，經(jīng)IPTG誘導得到以可溶性形式表達的重組BAG1，Western

8、 blotting分析顯示重組BAG1具有特異的免疫反應性。 2．成功建立弓形蟲慢性感染小鼠模型； 3．用rBAG1抗原與rSAG1、Toxo-Ag檢測弓形蟲慢性感染小鼠血清IgG抗體。結果顯示針對相應抗原的小鼠IgG抗體在不同時間水平有顯著差異（P<0．001）。針對不同抗原的小鼠IgG抗體有顯著差異，rBAG1-IgG顯著高于rSAG1-IgG和Toxo-Ag-IgG（P<0．001）。時間與抗原有顯著交互效應，主要

9、表現(xiàn)在抗rBAG1與rSAG1、Toxo-Ag的IgC抗體變化趨勢顯著不同（P<0．001）。 4．用rBAG1抗原與rSAG1、Toxo-Ag檢測弓形蟲慢性感染小鼠血清IgM抗體。結果顯示針對相應抗原的小鼠IgM抗體在不同時間水平有顯著差異（P<0．001）。針對不同抗原的小鼠IgM抗體無顯著差異，即rBAG1-IgM、rSAG1-IgM以及Toxo-Ag-IgM三者整體水平無顯著差異（P=0．070）。時間與抗原有顯著交互效

10、應，主要表現(xiàn)在抗rBAG1與rSAG1、Toxo-Ag的IgM抗體變化趨勢不同（P=0．008）。 5．用rBAG1抗原與rSAG1、Toxo-Ag檢測477份精神分裂癥患者血清中弓形蟲IgG抗體，陽性率分別為15．30％、11．74％和12．58％。結果顯示rBAG1與rSAG1兩種抗原檢測的陽性率有顯著差異（P=0．021），以rBAG1檢測的陽性率較高；兩種抗原檢測的吻合度一般（k=0．562）。rBAG1與Toxo-Ag

11、兩種抗原檢測陽性率無顯著差異（P=0．111），吻合度一般（r=0．503）。rSAG1與Toxo-Ag兩種抗原檢測的陽性率無顯著差異（P=0．665），吻合度一般（k=0．529）。 6．用rBAG1抗原與rSAG1、Toxo-Ag檢測477份精神分裂癥患者血清中弓形蟲IgM抗體，陽性率分別為8．18％、10．27％和12．79％。結果顯示rBAG1與rSAG1兩種抗原檢測的陽性率無顯著差異（P=0．099），兩種抗原檢測結果

12、的吻合度一般（k=0．625）。rBAG1與Toxo-Ag兩種抗原檢測的陽性率有顯著差異（P=0．001），吻合度一般（k=0．556）。rSAG1與Toxo-Ag兩種抗原檢測的陽性率有顯著差異（P=0．023），吻合度較強（x=0．754）。 7．rBAG1和rSAG1兩種抗原檢測254份孕婦血清中的IgG抗體陽性率分別為6．30％和5．91％，兩種抗原檢測的陽性率無顯著差異（P=1．000），吻合度一般（k=0．691）。兩

13、種抗原檢測的IgM抗體陽性率分別為2．76％和3．94％，兩種抗原檢測的陽性率無顯著差異（P=0．581），但兩種抗原檢測結果的吻合度較弱（x=0．210）。 8．rBAG1和rSAG1兩種抗原檢測210份獻血員血清中的IgG抗體陽性率分別為6．19％和5．71％，兩種抗原檢測的陽性率無顯著差異（P=1．000）；兩種抗原檢測結果的吻合度一般（x=0．617）。 結論： 1．成功構建表達質粒pET-28a（+）-

14、BAG1，在大腸埃希菌中以非融合蛋白形式高效、可溶地表達BAG1基因，獲得的重組蛋白可通過Ni-NTA純化，Westernblotting顯示重組BAG1蛋白具有良好的免疫反應性。 2．利用弓形蟲Prugniaud弱毒株包囊經(jīng)口方式感染小鼠，成功建立了弓形蟲慢性感染小鼠模型。 3．將重組BAG1抗原應用于弓形蟲慢性感染小鼠和人弓形蟲感染的檢測，結果顯示重組BAG1抗原具有良好的檢測效能，在弓形蟲慢性感染的診斷方面具有潛在