乙型肝炎病毒復(fù)制型小鼠模型的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、第一部分利用高壓注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染法實現(xiàn)HB3sAg在小鼠肝臟中的高效表達(dá)目的 觀察能否應(yīng)用高壓注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染法實現(xiàn)外源DNA在肝臟中高效表達(dá)，為嗜肝病毒的分子生物學(xué)研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。 方法將大容量乙肝病毒表面抗原(HBV Surface Antigen，HBsAg)表達(dá)質(zhì)粒pVAxl／S DNA溶液(每只小鼠注射的溶液總量為該小鼠體重的8％，如給體重為20g的小鼠注射的溶液為1.6m1)，通過尾靜脈快速(在5-8秒內(nèi))注射

2、入小鼠體內(nèi)，并采用緩慢注射法為對照。用免疫組化法檢測小鼠心、肺、肝、脾、腎組織中HBsAg的表達(dá)情況。 結(jié)果 經(jīng)小鼠尾靜脈高壓注射pVAXl／S質(zhì)粒DNA后，HBsAg主要在肝臟表達(dá)：且高壓注射組HBsAg的表達(dá)明顯強(qiáng)于緩慢注射組；高壓注射5ugpVAXl／S質(zhì)粒DNA后，4小時開始可在少數(shù)肝細(xì)胞中檢測到HBsAg表達(dá)表達(dá)，8小時達(dá)高峰，以后逐漸減弱，注射后10天的肝組織僅發(fā)現(xiàn)數(shù)個陽性細(xì)胞，19天時未見肝陽性細(xì)胞；高壓注

3、射5ug pVAXl／S質(zhì)粒DNA后8小時，在小鼠肝臟中檢測到較強(qiáng)的HBsAg的表達(dá)；當(dāng)將高壓注射質(zhì)粒DNA的量增加到10ug、25ug、50ug時，我們并未觀察到HBsAg的表達(dá)增強(qiáng)。 結(jié)論 通過尾靜脈高壓注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染法，本研究成功地將乙肝表面抗原表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，并實現(xiàn)HBsAg主要在肝臟高效表達(dá)。 第二部分乙型肝炎病毒復(fù)制型小鼠模型的建立及初步應(yīng)用 目的 1．建立一個方便、快速的乙型肝炎

4、病毒(Hepatitis B ViTUS，HBV)復(fù)制型小鼠模型，從而為HBV基因組功能和復(fù)制機(jī)理的研究，以及抗病毒藥物的篩選提供一個有用的工具。 2．將本試驗建立的HBV復(fù)制型小鼠模型初步應(yīng)用于觀察聚肌胞 (Polyinosinic-polytidylin Acid，p01yI.C)對HBV復(fù)制的抑制作用，以初步驗證該模型是否能應(yīng)用于HBV的相關(guān)研究。 方法 1．建立HBV復(fù)制小鼠模型

5、將復(fù)制型HBV重組質(zhì)粒DNA溶于相當(dāng)于小鼠體重8％的生理鹽水中，經(jīng)小鼠尾靜脈在短時間(5—8秒內(nèi))內(nèi)快速注射入6—9周的BALB／C小鼠體內(nèi)(高壓注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染法)。分別在注射后第l、3、4、5、7、10天處死小鼠，收集肝臟標(biāo)本。用Southern吸印雜交檢測HBV DNA復(fù)制中間體水平；免疫組化法檢測小鼠肝臟中乙肝病毒核心抗原(HBV CoreAntigen，HBcAg)和HBsAg的表達(dá)；用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linkedi

6、mmlmosorbentassay， ELISA)檢測小鼠血清中的HBsAg和乙肝病毒e抗原(HBV e Antigen，HBeAg)。 2．用本試驗建立的HBV復(fù)制型小鼠，觀察polyI.C誘生內(nèi)源性干擾素對HBV復(fù)制的影響。 在高壓注射24小時后，根據(jù)血清HBeAg進(jìn)行配對，分為試驗組和對照組。試驗組(polyI.C組)通過腹腔注射給予polyI．C 200μg／次，隔日一次， 共注射三次。同時，給對照組(PBS

7、組)注射磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，注射方式、注射時間和次數(shù)與試驗組相同。最后一次注射后4—6小時處死小鼠，并比較兩組小鼠體內(nèi)HBV DNA復(fù)制中間體的水平。 結(jié)果 1．經(jīng)小鼠尾靜脈高壓注射復(fù)制型HBV重組質(zhì)粒DNA后，能夠在小鼠的肝臟檢測到較高水平的HBV DNA復(fù)制中間體和HBcAg、HBsAg，并能在 小鼠血清中檢測到HBsAg和HBeAg，提示HBV能在小鼠肝臟復(fù)

8、制表達(dá) 并能分泌入血清。注射后第1天即可檢測到HBV DNA復(fù)制中間體，其 水平在注射后第3天最高，之后略為下降，并在第4—7天維持穩(wěn)態(tài)； 注射后第10天幾乎檢測不到。HBV特異性抗原的表達(dá)(肝組織的 HBsAg、HBcAg和血清HBsAg、HBeAg)，在注射后1天達(dá)高峰，以后的變化情況與HBV DNA復(fù)制中間體相似。 2．在尾靜脈高壓注射法建立的HBV復(fù)制型小鼠中，同一只小鼠的肝臟 左、中、右葉中HBV DNA復(fù)制