CRISPR相關(guān)蛋白的識別及功能分析.pdf

1、成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（CRISPR）-CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）是細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可以被改造成強(qiáng)大的基因組編輯工具而受到廣泛關(guān)注。CRISPR-Cas系統(tǒng)會保留入侵者的一小段遺傳物質(zhì)（被稱為間隔序列）以抵御入侵者的再次感染。組成這個免疫系統(tǒng)的 Cas蛋白以及編碼 Cas蛋白的 cas操縱子結(jié)構(gòu)具有極其豐富的多樣性。描述cas操縱子結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵一步是cas基因（或Cas蛋白）的準(zhǔn)確識別。而且，隨著新測序的細(xì)菌和古

2、細(xì)菌基因組的不斷增加，極有可能識別出新的 Cas蛋白，這些新的 Cas蛋白不僅可以為基因組編輯工具提供候選物，也有助于更深入地理解這個免疫系統(tǒng)。因此，我們開發(fā)了HMMCAS，一個識別 Cas蛋白的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)。這個網(wǎng)絡(luò)服務(wù)收集了所有已知的 Cas蛋白家族隱馬爾可夫模型（HMMs），使用HMMER3.1中的hmmscan相似性搜索算法快速準(zhǔn)確地識別 Cas蛋白。HMMCAS也可以識別融合蛋白比如細(xì)菌 Candidatus Chloracido

3、bacterium thermophilum B（Cab. thermophilum B）中的Cas1-Cas4融合蛋白。這個網(wǎng)絡(luò)服務(wù)也可以發(fā)現(xiàn)潛在的 cas操縱子并指出 cas操縱子所屬類型。HMMCAS的網(wǎng)址為http://i.uestc.edu.cn/hmmcas/。
　　接下來，我們利用相似性搜索識別了細(xì)菌和古細(xì)菌參考基因組中的cas基因，通過基因上下文檢查找到了由 cas基因組成的潛在的 cas操縱子。我們依據(jù)CRISP

4、R-Cas系統(tǒng)的標(biāo)簽基因?qū)撛诘腸as操縱子分類。我們發(fā)現(xiàn)與II型、III型、IV型和V型系統(tǒng)相比，I型系統(tǒng)是分布最廣泛、數(shù)量最多的CRISPR-Cas系統(tǒng)。我們也重點(diǎn)關(guān)注了II型系統(tǒng)的cas位點(diǎn)，根據(jù)II型cas位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)組成，新增加了II-A1、II-B1、II-C1、II-C2、II-D五種亞型。從cas位點(diǎn)組成來看，我們認(rèn)為II-A1是退化了的II-A系統(tǒng)，與II-A相比缺少編碼Cas2蛋白的基因；II-B1是退化了的II-B系

5、統(tǒng)，相比缺乏編碼Cas1、Cas2兩個蛋白的基因；II-C1和II-C2是退化了的II-C系統(tǒng)，分別缺乏編碼Cas2和Cas1蛋白的基因。Cas9蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹也可以說明這樣的進(jìn)化關(guān)系。特別地，亞型II-D編碼的Cas蛋白盡管沒有形成單一的分支，但都與亞型II-C、II-C1、II-C2的Cas9蛋白聚在一起，說明亞型II-D可能是退化了的 II-C系統(tǒng)，也可能是退化了的 II-C1、II-C2系統(tǒng)。此外，我們也發(fā)現(xiàn)II型系統(tǒng)分別與I

6、、II、III、V型系統(tǒng)存在融合。
　　最后，我們通過注釋位于cas位點(diǎn)但功能未知的基因，發(fā)現(xiàn)cas位點(diǎn)具有編碼毒蛋白、抗毒蛋白以及argonaute（Ago）蛋白的基因。具體地，我們發(fā)現(xiàn)4個毒蛋白家族：AAA_21、AbiEii、HicA和 Fic；4個抗毒蛋白家族：PhdYeFM、MazE、Unstab和BrnA。我們發(fā)現(xiàn)在抗毒蛋白基因下游往往存在毒蛋白基因，這樣的組織結(jié)構(gòu)有利于細(xì)菌生產(chǎn)更多的抗毒蛋白。對于所有的4個抗毒蛋白家