大豆疫霉信號(hào)識(shí)別顆粒亞基SRP54及動(dòng)力相關(guān)蛋白基因VPS1功能分析.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthorasojae）侵染大豆引起的根腐病是大豆生產(chǎn)的毀滅性病害之一。大豆疫霉在與寄主的互作過(guò)程中會(huì)分泌大量的外泌蛋白，過(guò)去幾年的研究已經(jīng)證明，這些外泌蛋白通過(guò)干擾植物免疫反應(yīng)，在病原菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但是這些外泌蛋白如何被運(yùn)輸?shù)桨鈩t缺乏研究，對(duì)病原菌控制該過(guò)程分子機(jī)理的研究對(duì)針對(duì)該過(guò)程發(fā)展新的病害控制策略具有重要價(jià)值。盡管關(guān)于真核生物蛋白分泌途徑已經(jīng)有一些研究，但是由于卵菌與其他真核生物遺傳距離很遠(yuǎn)，

2、其發(fā)育與致病的機(jī)理均缺乏研究。本文綜合利用生物信息學(xué)，realtimeRT-PCR，基因沉默技術(shù)對(duì)大豆疫霉信號(hào)識(shí)別顆粒亞基SRP54和動(dòng)力相關(guān)蛋白VPS1在大豆疫霉蛋白分泌過(guò)程中的作用進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，希望為解釋疫霉菌的致病機(jī)理，設(shè)計(jì)新的疫病控制策略提供幫助。
　　大豆疲霉信號(hào)識(shí)別顆粒亞基SRP54和動(dòng)力相關(guān)蛋白VPS1的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及轉(zhuǎn)錄分析.信號(hào)識(shí)別顆粒是真核生物中普遍存在的一個(gè)重要的復(fù)合體，通過(guò)識(shí)別核糖體上新生肽的信號(hào)肽，

3、并與之結(jié)合，將外泌多肽易位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)入外泌途徑，而動(dòng)力相關(guān)蛋白VPS1影響了高爾基體上包被了液泡蛋白的囊泡出芽，并最終影響外泌蛋白的外泌。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法方法從大豆疫霉、橡樹疫霉和致病疫霉等的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘出信號(hào)識(shí)別顆粒亞基SRP54候選編碼基因。對(duì)P.sojae，P.parasitica,P.cinnamomi,P.capsiciP.ramorum,P.infestan,H.Arabidopsis,Pythium和S

4、.parasitica9種卵菌中SRP54及VPS1的候選基因之間進(jìn)行了同源性比較，分析了蛋白的結(jié)構(gòu)特征。PsSRP54蛋白具有保守的GTPase結(jié)構(gòu)域，富含蛋氨酸的C端結(jié)構(gòu)域，它能結(jié)合7SRNA也能結(jié)合信號(hào)肽。而且VPS1蛋白在N端也具有保守的GTPase結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明這兩個(gè)蛋白在進(jìn)化過(guò)程中非常的保守。利用RNA-sequencing和qRT-PCR等技術(shù)分析了大豆疫霉中SRP54及VPS1候選編碼基因在生活史及侵染各個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄情況，

5、發(fā)現(xiàn)SRP54在茵絲階段、孢子囊階段、侵染1.5h、3h、6h、12h及24h階段均上調(diào)表達(dá)，而VPS1在菌絲階段、孢子囊階段、休止孢萌發(fā)階段、侵染1.5h、3h、6h、12h及24h階段也均上調(diào)表達(dá)，這意味著兩個(gè)基因在侵染過(guò)程中起著重要的作用，這為后續(xù)功能基因研究提供了重要的線索。
　　信號(hào)識(shí)別顆粒亞基PsSRP54參與了卵孢子的形成、蛋白的外泌和致病過(guò)程:在本章研究中，通過(guò)生物信息學(xué)鑒定了一個(gè)大豆疫霉PsSRP54基因，該基因

6、編碼一個(gè)信號(hào)識(shí)別顆粒的54亞基。利用大豆疫霉穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，獲得了該基因的3個(gè)沉默突變體。PsSRP54的沉默突變體在固體平板上減少胞外過(guò)氧化物酶的外泌量，液體培養(yǎng)基的濾液（及胞外蛋白）在本氏煙草葉片上引起壞死的能力顯著下降，通過(guò)SDS-PAGE蛋白的測(cè)定發(fā)現(xiàn)CBEL激發(fā)子的分泌量明顯降低;通過(guò)接種含有抗病基因的鑒別寄主沉默轉(zhuǎn)化子不能引起明顯的HR反應(yīng)，對(duì)比胞外蛋白顯示沉默轉(zhuǎn)化子的外泌蛋白量明顯降低;沉默轉(zhuǎn)化子接種感病品種致病力明顯減弱。

7、同時(shí)在獲得的OEX-Avr1b菌株（在P6497中過(guò)量表達(dá)Avr1b-RFP-HA）中瞬時(shí)沉默PsSRP54得到的轉(zhuǎn)化子能夠恢復(fù)菌株在Harosoy13xy(RPS1b)的致病力。通過(guò)熒光觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子中的熒光明顯減弱，而且Westernblot顯示轉(zhuǎn)化子與OEX-Avr1b相比Avr1b的外泌量明顯降低。與對(duì)照相比，PsSRP54的沉默并沒(méi)有影響茵絲生長(zhǎng)速度，孢子囊的形成及游動(dòng)孢子的釋放，但是卵孢子的形成和產(chǎn)量顯著降低P6497中在1

8、0倍鏡視野下平均70個(gè)，而沉默突變體中平均只有5個(gè)。上述結(jié)果表明，PsSRP54可以調(diào)控大豆疫霉胞外蛋白的分泌及效應(yīng)分子的外泌，進(jìn)而影響致病力，而且參與了卵孢子的形成。
　　動(dòng)力相關(guān)蛋白VPS1參與調(diào)控大豆麥霉休止孢萌發(fā)，蛋白外泌爭(zhēng)致病過(guò)程:VPS1編碼一個(gè)典型的動(dòng)力相關(guān)蛋白，同時(shí)PsVPS1也作為液泡分選蛋白一員，而且在已測(cè)序的卵茵中是高度保守的。通過(guò)利用大豆疫霉穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將該基因沉默并獲得了3個(gè)沉默轉(zhuǎn)化子。PsVPS1沉默突

9、變體的生長(zhǎng)速度顯著降低，沉默轉(zhuǎn)化子平均每天生長(zhǎng)速率為0.65cm，而P6497平均為0.9cm。PsVPS1沉默后對(duì)游動(dòng)孢子產(chǎn)量沒(méi)有顯著影響，同時(shí)游動(dòng)孢子的游動(dòng)行為也沒(méi)有受到顯著影響，具有正常的趨化性;有性生殖也沒(méi)有變化，卵孢子形態(tài)及產(chǎn)量與野生型沒(méi)有差異。但是沉默突變體中休止孢萌發(fā)出現(xiàn)顯著異常，休止孢萌發(fā)的頂端膨大，而且分枝增加，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞壁染色觀察發(fā)現(xiàn)，葡聚糖的分布受到顯著的影響。PsVPS1沉默突變體在固體平板上胞外過(guò)氧化物酶外泌

10、量明顯降低，接種鑒別寄主發(fā)現(xiàn)沉默轉(zhuǎn)化子失去引起HR反應(yīng)的能力。轉(zhuǎn)化子接種感病品種致病力明顯下降，通過(guò)顯微觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的休止孢能夠正常的穿透寄主表皮，但是侵染菌絲不能在寄主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)展。以上結(jié)果表明，PsVPS1沉默影響了休止孢的正常萌發(fā)及極性生長(zhǎng)，同時(shí)減弱了胞外蛋白的外泌，降低了在感病品種的致病力。
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示PsSRP54和PsVPS1在外泌途徑中非常的保守，而且在侵染的不同階段都上調(diào)表達(dá)。功能分析發(fā)