豬抗PRRSV相關(guān)基因的鑒定及功能分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合癥（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)引起的一種病毒性傳染病。PRRS導(dǎo)致妊娠母豬嚴重繁殖障礙，仔豬高死亡率以及各年齡段尤其仔豬的呼吸道疾病。PRRSV的基因組是高度可變的，由于這種變異，沒有有效的疫苗可以利用，即使是接種疫苗，仍有部分豬感染PRRSV，因此培育具有抗PRRSV的豬是解決這一難題的切實可行的途徑。本研究利用基因表達譜芯片技術(shù)對大蒲蓮豬和杜-大-長商品豬感染PRRSV后肺臟組織基因表達譜差異

2、進行了研究。在候選基因的研究上，我們對豬干擾素受體（IFNGR1，IFNAR2）進行了克隆,分析了IFNGR1、IFNAR2 mRNA在豬不同組織中的表達及PRRSV 感染對其mRNA表達的影響。主要結(jié)果如下：
　　 ⑴對6周齡的大蒲蓮豬及杜-大-長商品豬進行人工攻毒，試驗組鼻內(nèi)接種PRRSV標(biāo)準(zhǔn)毒株（JXA1），對照組鼻內(nèi)接種PBS。攻毒后每天直腸測量體溫，攻毒后0 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d稱量體重、采

3、血并測定細胞因子（IL-1β、IL-2、IL-10、IFN-γ和INF-a），免疫球蛋白IgG等指標(biāo)并進行血細胞計數(shù)。對攻毒4 d、7 d、14 d、21 d和28 d血清中的PRRSV進行RT-PCR及絕對real-time PCR的檢測，結(jié)果表明，攻毒 0-28 d，大蒲蓮豬沒有出現(xiàn)比較明顯的臨床癥狀；杜-大-長商品豬則表現(xiàn)出比較明顯的臨床癥狀和病理變化：臨床癥狀有發(fā)燒（體溫高達42 ℃）、耳部皮膚發(fā)紺、出現(xiàn)紅斑、眼瞼水腫、打噴嚏、

4、呼吸急促，嗜睡等，解剖病理學(xué)變化有肺間質(zhì)增寬、肺水腫，肺臟表面有大小不等，程度不同的出血和淤血；氣管、支氣管出血，淋巴結(jié)水腫、出血；脾臟變硬，有出血點，肺萎縮及胸部積水。攻毒 0 d-14 d，大蒲蓮豬，血清中TNF-α含量顯著升高，血清IL-10的含量變化則不同，14 d 時大蒲蓮豬仍維持較高的水平，而杜-大-長商品豬則下降；在大蒲蓮豬和杜-大-長商品豬中，血清IFN-γ的變化呈現(xiàn)先降后升的動態(tài)特征，IgG的含量隨時間變化呈現(xiàn)上升趨勢

5、，都在14 d達到最高峰。血細胞計數(shù)分析結(jié)果表明攻毒后，部分大蒲蓮豬和杜-大-長商品豬白細胞總數(shù)偏低或升高，其它指標(biāo)基本沒有變化。RT-PCR及絕對real-time PCR的檢測結(jié)果表明，大蒲蓮豬血清中PRRSV的含量低于杜-大-長商品豬。
　　 ⑵利用表達譜芯片分析了大蒲蓮豬及杜-大-長商品豬感染PRRSV后肺臟組織差異基因表達的情況，找到了259個差異表達的基因，其中上調(diào)基因105個，下調(diào)基因154個，聚類分析表明大蒲蓮豬

6、具有相似的表達模式，先聚在一類，杜-大-長商品豬具有相似的表達模式，聚在另一類。GO分析表明差異表達基因主要參與細胞生物學(xué)過程，生理學(xué)過程，發(fā)育過程，生物調(diào)節(jié)過程和免疫系統(tǒng)等生物學(xué)過程。對其中的12個基因進行了real –time PCR的驗證，有11個基因與基因芯片結(jié)果一致，其中上調(diào)基因6個，分別是：ENPEP、TF、USP18、Scarb2、CACNA2D1和CYP3A29基因，下調(diào)基因5個，分別是：GSTA2，CYP3A88、AT

7、P1B1，LPL和MRC1基因。其中，CYP3A29、USP18、IF和ENPEP的mRNA表達水平，大蒲蓮豬分別是杜-大-長商品豬的9.09、7.10、6.24和5.43倍，而CYP3A88和GSTA2的mRNA的表達水平，大蒲蓮豬僅為杜-大-長商品豬的1 ％和4 ％。通過對攻毒前后大蒲蓮豬和杜-大-長商品豬上述基因表達水平的對比分析，初步確定ENPEP、TF、USP18、CYP3A29等為與豬對PRRSV的抗性有關(guān)的基因，CYP3A

8、88、GSTA2等為與豬對PRRSV的易感性有關(guān)的基因。
　　 ⑶通過RT-PCR及 5′-和3′-RACE，我們得到了豬IFNGR1基因完整的cDNA序列，得到兩個轉(zhuǎn)錄本，這兩個轉(zhuǎn)錄本只是具有5′-UTR的不同。豬IFNGR1基因核苷酸序列與小鼠，大鼠，人和牛的同源性分別是63.73 ％，62.95 ％,72.90 ％和 81.10 ％。豬IFNGR1基因氨基酸序列與小鼠，大鼠，人和牛的同源性分別是46.69 ％,45.64

9、％，58.04 ％和72.55％。豬IFNGR1基因位于1號染色體上，包括7個外顯子和6個內(nèi)含子。對豬IFNGR1基因的mRNA 14種組織表達譜進行了分析，該基因在檢測的組織中均表達，其中，脾臟、淋巴結(jié)，扁桃體、肝臟的表達相對強一些，小腸，大腸和子宮中的表達量弱一些。對萊蕪豬、杜洛克豬成年豬及仔豬 5種組織中IFNGR1基因mRNA的表達情況進行了real-time PCR的分析。結(jié)果表明在不同品種、不同組織中IFNGR1基因mRNA

10、的表達情況存在差異。為了研究PRRSV對豬IFNGR1基因mRNA表達的影響，我們選擇了大蒲蓮豬和杜-大-長商品豬的肺臟，脾臟和淋巴結(jié)進行了研究。在大蒲蓮豬感染PRRSV后，肺臟IFNGR1基因mRNA的表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，然而，淋巴結(jié)IFNGR1基因mRNA的表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。在杜-大-長商品豬感染 PRRSV后，肺臟，脾臟，淋巴結(jié)的表達量有一定的變化，但是沒有達到顯著水平(P>0.05)。
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11、通過RT-PCR和5′-RACE技術(shù)，我們獲得了豬IFNAR2 cDNA序列，大小為 2882 bp，豬IFNAR2基因包括9個外顯子和 8個內(nèi)含子，其氨基酸序列與小鼠、人、綿羊和牛的同源性分別是38.18 ％、55.29 ％、62.01 ％和63.39 ％。豬IFNAR2基因14種組織中mRNA的表達的相對量被檢測，該基因在檢測的組織中均表達，其中，脾臟、小腸、大腦和子宮中的表達相對強一些，胃中的表達量相對弱一些。我們對萊蕪豬、杜洛克

12、豬成年豬及仔豬5種組織中IFNAR2基因mRNA的表達情況進行了real-time PCR的分析，結(jié)果表明不同品種、不同組織中IFNAR2基因mRNA表達水平存在差異。在大蒲蓮豬中，與非感染的對照組相比，感染PRRSV后，肺臟、脾臟和淋巴結(jié)IFNAR2 mRNA的表達量沒有顯著差異(P>0.05)；在杜-大-長商品豬中，與非感染的對照組相比，感染PRRSV后，肺臟IFNAR2mRNA的表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。
　　 ⑸對

13、大蒲蓮豬抗PRRSV的機理進行了探討。結(jié)果顯示，大蒲蓮豬和杜-大-長商品豬對PRRSV反應(yīng)不同，在PRRSV感染后肺組織中表達的基因具有較大差異。首次克隆了豬IFNGR1和IFNAR2基因并對其組織表達進行了分析，證明PRRSV感染后這兩個基因分別在大蒲蓮豬和杜-大-長商品豬淋巴結(jié)和肺以及肺組織中的表達水平存在差異。本研究找到了一些肺組織中表達，與豬對PRRSV的抗性和易感性有關(guān)的基因，為進一步探討豬PRRS的發(fā)病機理以及找到與豬抗PR