5’-脫氧氟尿苷聯(lián)合干擾素對轉染胸苷磷酸化酶基因結腸癌細胞裸鼠實驗模型的影響.pdf

1、胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）是嘧啶核苷合成和分解過程中的一個關鍵酶。目前學界的研究認為TP與血小板源性內皮細胞生長因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PD-ECGF）具有同源性，其誘導血管形成和抗凋亡的作用與結直腸腫瘤的生長、轉移能力密切相關。同時TP也是使5'-脫氧氟尿苷（5’-deoxy-5-fluorouridine，5'-D

2、FUR）、卡培他濱（capecitabine， CAP）等5-FU前體藥物轉化為5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），干擾細胞DNA的合成、發(fā)揮抗腫瘤作用的關鍵酶，其活性與結直腸癌細胞對氟尿嘧啶前體類藥物的敏感性及靶向治療密切相關。因此TP在結直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后有著雙重作用。
　　大量臨床研究證實，在腫瘤組織中TP的活性明顯高于周圍的正常組織，但在不同的腫瘤組織中，TP表達的具體部位、活性卻不盡相同。關于

3、結直腸癌及轉移組織中表達TP的具體部位報道各異。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在人結直腸癌組織中，TP蛋白主要由間質細胞表達，尤其是腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophage，TAM），而非腫瘤細胞本身。近年來的研究表明干擾素-α2a（interferon-α2a，IFN-α2a）可上調人結腸癌細胞LOVO和LS174T中TP的mRNA表達水平。提示臨床上可通過應用這些細胞因子增強5'-DFUR的化療效果。
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4、-FU是臨床上用于消化道惡性腫瘤化療的主要藥物，但因有嚴重的副作用而使其臨床應用受到一定的限制。近年被其前體藥物如5'-DFUR、卡培他濱等逐漸代替，這些前體藥物本身無細胞毒性作用，只有在腫瘤組織中被關鍵酶TP轉化為5-FU后才能對細胞產生毒性作用。這樣既有效的抑制了腫瘤的生長，又消除了潛在的血管生長因子，實現(xiàn)了抗腫瘤生長與抗腫瘤血管生成的統(tǒng)一。因此提高腫瘤組織內TP的表達有利于提高此類藥物的抗腫瘤效應，我們前期研究發(fā)現(xiàn)在體外實驗中，將

5、TP基因通過慢病毒轉染進結腸癌細胞后，顯著提高了5'-DFUR對LOVO、HT29、LS174T細胞株的抑制效果，聯(lián)用干擾素-α2a可以使LOVO細胞轉化5'-DFUR為5-FU的能力進一步增強，提高5'-DFUR對該腫瘤細胞的抑制作用。
　　本實驗我們采用慢病毒為載體將TP基因轉入結直腸癌LS174T細胞株中，然后接種于裸鼠背部制作裸鼠結腸癌模型，利用5'-DFUR、5-FU聯(lián)合干擾素α2a對轉染TP前后裸鼠結腸癌模型進行治療，

6、最后處死裸鼠、留取腫瘤標本做石蠟切片免疫組織化學染色，觀察轉染TP基因前后腫瘤組織內TP、VEGF、CD34表達的不同。
　　目的:
　　探索在轉染TP基因的裸鼠結直腸癌腫瘤模型中，干擾素-α2a對TP表達、微血管生成，及對5`-DFUR與5-FU抗腫瘤作用方面的影響。
　　方法:
　　以慢病毒為載體將TP基因轉染至結腸癌細胞株LS174T，得到穩(wěn)定的TP高表達細胞株LS174T-TP，并傳5代后在流式細胞儀上檢

7、測其轉染率。將96只BALB/c裸鼠分成2組，每組48只，分別應用野生型、及轉染TP基因后的LS174T-TP細胞株接種裸鼠背部皮下，分別制作裸鼠結腸癌TP低、高表達模型。每組再隨機分為6小組，分別應用（1）生理鹽水（對照）、（2）干擾素-α2a、（3）5-FU、（4）5-FU+干擾素-α2a、（5）5’-DFUR、（6）5’-DFUR+干擾素-α2a，進行干預，連續(xù)用藥5天，并對裸鼠體重進行測量、記錄，觀察其狀態(tài)。2周后處死各組裸鼠，

8、分離皮下腫瘤稱重后，用福爾馬林液固定、石蠟包埋、切片后分別應用鼠抗人CD34、VEGF和抗PD-ECGF單克隆抗體對腫瘤進行免疫組織化學染色，統(tǒng)計其腫瘤組織內TP表達、VEGF、腫瘤微血管密度（microvesseldensity,MVD）在不同處理組之間的差異。
　　結果:
　　以慢病毒為載體將TP轉染進LS174T細胞株后，傳5代后、各代轉染率均在95％以上。所有接種結腸癌細胞的裸鼠均成功建立模型，且在實驗過程中無中途死

9、亡個體。5天給藥結束后，相比各自對照組，兩種裸鼠模型中，5-FU組與5-FU+干擾素α組裸鼠體重明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；5’-DFUR組與5’-DFUR+干擾素α組體重也有輕度降低，但差異無統(tǒng)計學意義。在野生型LS174T裸鼠荷瘤模型中，使用抗腫瘤藥的3~6組腫瘤重量與對照組相比均明顯降低，抑癌率分別為48%、27%、48%、57%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其中5'-DFUR組（48%）與5'-DFUR

10、+干擾素α組（57%）、5-FU+干擾素α組與5'-DFUR+干擾素α組（27%與57%）比較抑癌效率，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。5-FU組與5-FU+干擾素α組對比，抑癌效率之間無統(tǒng)計學差異（P>0.05），在LS174T-TP細胞株裸鼠模型中，5'-DFUR組、5'-DFUR+干擾素α組抑癌率分別為27%、48%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；5'-DFUR組與5-FU組、5'-DFUR+干擾素α組與5-FU+干擾素

11、α組之間對比，5'-DFUR治療效果更好（27%、48%VS7%、3%），且差異之間有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而使用5-FU的兩組未顯示出良好的抗腫瘤效果（7%、3%）。免疫組織化學染色結果顯示轉染TP基因后，裸鼠腫瘤組織中TP的表達上升，微血管密度增加。而使用干擾素-α2a后腫瘤組織中的TP表達、MVD差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　轉染TP基因后,LS174T細胞株裸鼠模型的TP表達顯著增強，有效提高了5'-DF